試驗(yàn)項(xiàng)目二住骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的倍增時(shí)間與生長曲線的測定資料

1、PMSCs生長曲線和倍增時(shí)間的測定【1】來自豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其成脂分化：取生長狀況良好的 P1、P3、P5、P9代細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液，在37C消化1-3min , 制成單細(xì)胞懸液，然后以 5x104個(gè)/ml密度接種到30個(gè)直徑為35mm培養(yǎng)皿中，隨 機(jī)分成10組，每組3皿，每天檢測一組中每皿的細(xì)胞總數(shù)，取3個(gè)皿的均值，如此至第10組結(jié)束，細(xì)胞技術(shù)如下（2004,司徒鎮(zhèn)強(qiáng)）即一天消化3個(gè)組，共消化10天。P1, P3,P5, P9均如此，每代 30個(gè)皿，共計(jì)120個(gè)皿。350300250200IW10050PIP?P9P150LJ1J1j1112345678910培養(yǎng)時(shí)間

2、(Time of culture) (d)細(xì)胞群體倍增時(shí)間（PDT） =（t-t°）|g2/（lgN t-IgN。） t。培養(yǎng)起始時(shí)間，t,培養(yǎng)終止時(shí)間;No培養(yǎng)初始細(xì)胞數(shù)，Nt培養(yǎng)終止細(xì)胞數(shù)?！?】增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性觀察用0.25%胰酶將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞克隆消化為單個(gè)細(xì)胞，用PBS洗2遍，1x105個(gè)細(xì)胞加入75卩I破膜劑，振蕩10s加入PI染料700卩I,室溫避光30min,上機(jī)檢測；選同期培養(yǎng)的為 轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照組，比較 EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響，分別計(jì)算出靜止期G0/G1 ,增殖期S%,和 G2/M【3】兩種方法分離小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的比較分別取

3、兩組0,1,3代細(xì)胞，制成1x103的細(xì)胞懸液，接種到 96孔板，每孔細(xì)胞懸液 200 微升，置37C、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育，各組每24小時(shí)分別取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml） 20微升37C孵育，4h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150微升分析純的二甲基亞砜，移至酶聯(lián)免疫檢測儀上振蕩10min,用分光光度計(jì)在 492nm波長處測定每孔的吸光度值（OD492）,以O(shè)D（492）值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線?！?】人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究取不同代數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2x104/ml后，接種于96孔培養(yǎng)板，置37 C, 5%CO2 , 飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)后

4、，用胰酶-EDTA進(jìn)行消化，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，每天取 12復(fù)孔，共7天；根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。記錄測得的結(jié)果，即培養(yǎng)潛伏期持續(xù)多長時(shí)間（12-24h），多長時(shí)間進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期（3天后），對(duì)數(shù)增殖期持續(xù)時(shí)間（3-5天），鋪滿 皿底所需時(shí)間（5-7天），細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期多長時(shí)間及持續(xù)多長時(shí)間，停止生長時(shí)間?！?】 來自;山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)，選擇P1, P5, P9 （即早、中、晚三代）作生長曲線，進(jìn)行觀察，記錄各自的潛伏期, 對(duì)數(shù)生長期，平臺(tái)期窘3衣E齬翼山羊BMSC原代培養(yǎng)生長曲線繪制。1 2 3 4 5 & 7 6 9 1 培養(yǎng)天刼合皀1 X】E毎黑晁山羊

5、BMSC P1、P5、P9代生長曲線?！?】來自：胎豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核移植及核移植胚胎干細(xì)胞的分離將傳至第 4 代生長旺盛 pFMSCs（porcine fetal mesenchymal stem cells）細(xì)胞用 0.25%胰酶 +0.04%EDTA（稱取胰蛋白酶 0.5g和EDTA0.08g,溶入200mlPBS中，常溫磁力攪拌器攪拌直 至徹底溶解，用0.22卩m孔徑的濾膜過濾，無菌條件分裝成小瓶（4ml/瓶），-20 C凍存）消化3-5min,培養(yǎng)液中和，吹打成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2x104個(gè)/ml,接種在兩個(gè)12孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中，每孔接種 1ml,再補(bǔ)加培養(yǎng)液1ml,混勻。

6、38.5C, 5%CO2,飽和濕度的條件下培養(yǎng)。 常規(guī)換液。每24h用0.25%胰酶+0.04%EDTA消化液消化3孔細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算每孔細(xì) 胞總數(shù)，每孔記2次，取平均值。細(xì)胞接種當(dāng)天記為第0天，連續(xù)測定8天。以時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，每天測定 3孔細(xì)胞數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。胎豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期化處理：血清饑餓處理（當(dāng)細(xì)胞生長到80%匯合時(shí)，將血清濃度由10%降成0.5%，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天；或者是利用接觸抑制處理（當(dāng)細(xì)胞生長至 80% 匯合時(shí)，繼續(xù)使用含 10%NBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2-3天。將上述處理的細(xì)胞常規(guī)消化離 心，PBS重懸細(xì)胞，按每管106細(xì)胞分裝于10ml離心

7、管，離心，0.5mlPBS重懸細(xì)胞，邊振 蕩邊緩慢加入 3ml預(yù)冷的75%乙醇，4C過夜固定12h以上，離心去除乙醇，用含 1%NBS 的PBS重懸細(xì)胞,離心洗滌 2遍，200卩l(xiāng)PBS重懸細(xì)胞,加入0.8mg/mlRNase 1ml,37C,30mi n. 離心，200微升PBS重懸細(xì)胞。加入含有100卩g/mlPI0.1%X-100 的PBS 1ml,室溫下作用10-15min , 100目濾沙過濾，上機(jī)檢測。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。6C0123456789 培養(yǎng)天數(shù)(d)圖G1胎豬骨髓pMSCa生長曲線Fig 6-1 Growth curve of pMSCs【7】 來自：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

8、分離培養(yǎng)及其核移植胚胎發(fā)育潛能研究生長曲線測定：取第 3代MSCs細(xì)胞，以每孔5.0x104個(gè)/ml接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)。 在37.5 C, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取 2孔，連續(xù)7天，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法 計(jì)算每孔的細(xì)胞數(shù)，取平均值，即細(xì)胞數(shù)/毫升原液=（5個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)之和/5） x104. 繪制生長曲線，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。貼壁率曲線的測定：取 pMSCs第3代細(xì)胞，以每瓶 5x104個(gè)/cm2密度接種到12個(gè) 25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每 2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（未含貼壁細(xì)胞），0.25%胰蛋白酶 消化貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)貼壁率，繪制貼壁率曲線。計(jì)算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)

9、胞數(shù)x100%分裂指數(shù)測定：用0.25%胰蛋白酶消化第3代細(xì)胞，以1x104個(gè)/cm2密度接種鋪有蓋 玻片的6孔培養(yǎng)板中37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 24h取出觀察一次，PBS 清洗三遍后，95%乙醇固定 10min,PBS清洗三遍，置于 5卩g/ml DAPI內(nèi)染色10min,PBS清洗后，滴加甘油油滴，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)分裂相細(xì)胞，取平均值。連續(xù)7天，以時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞分裂相的千分率（% ）為縱坐標(biāo)，繪制分裂指數(shù)曲線圖?！?】 來自：兩種培養(yǎng)方法在豬自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的比較研究直接貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)時(shí)受紅細(xì)胞影響容易失敗，且培養(yǎng)時(shí)潛

10、伏期較長，一般為11-13天，15-17天進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，20天左右進(jìn)入生長平臺(tái)期。密度梯度離心結(jié)合 直接貼壁法培養(yǎng)原代細(xì)胞較單純直接貼壁法培養(yǎng)潛伏期較短，一般為7-9天，11-15天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，17天左右進(jìn)入生長平臺(tái)期。1113時(shí)何GH細(xì)腕致悴tx i<r）團(tuán)9 2種方法壇養(yǎng)的僚牝細(xì)胞生飪曲圾Fi止 3 Gwwihcu_rc of MSCSL? iv o （IHTerciLLiiLeLiiods【9】 來自：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及核移植后重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的研究生長曲線：取pMSCs和PF第3代細(xì)胞，分別以每孔密度 5x104和6.5X104接種到24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，上述條件培

11、養(yǎng)，每天取 3孔，連續(xù)7天，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù) 每孔的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/毫升原液=（5大格細(xì)胞數(shù)之和/5）x104,繪制生長曲線。pMSCs貼壁率曲線的測定：取pMSCs第3代細(xì)胞，以每瓶5x104密度接種到12個(gè)25ml 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（含有未貼壁細(xì)胞），0.25%胰蛋白酶消化 貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算貼壁率。計(jì)算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)x100%.繪制貼壁率曲線。PMSCs分裂指數(shù)測定：用 0.25%胰蛋白酶消化第 3代細(xì)胞，以1x104密度接種鋪有 蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中37C, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取出觀察一次，PBS

12、 三遍后，95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍，置于 5卩g/mIDAPI內(nèi)染色10min,PBS 清洗后，蓋在滴有甘油的載玻片上，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)分裂相細(xì)胞，取平均值。連續(xù)7天，以時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞分裂相的千分率（°）為縱坐標(biāo)，繪制分裂指數(shù)曲線圖。pivtsc- s +11 pp 鄰 鼻11*11 3 , pM-SC& m 3 足址入推 at "忙衣 KU. 4 心 i U -I i- H.| :ifu F*P 僻列4理辰 HH牡上扃 pMS<ZTR. fl ：舘 4 X Ai »J 1產(chǎn)f r iV

13、| r. 執(zhí) 曲：用q f殲申 n寸 inj if V7 弋 th = t$ 畑r f TMr-.i "音iT* 斗玄購十洱 罕 £>MSC：m tKjR4 I'd V-j3.48tv PHna 30.0111，ft7ftFl-fE t U nyjiti i忡審 2 心 pM se Hr tUiT h o rvwth cii r v-e m rui ItLircl cHr t hXrd p-nsea2.4 pMSCs分裂指數(shù)的測定第3代pMSCs細(xì)胞分裂指數(shù)曲線如（圖2）, 接種后24h分裂的細(xì)胞比較少，第4大時(shí)達(dá)峰值 （23.6.7） %。，此厲逐漸F隱，至

14、第7天后幾乎 未見細(xì)胞分裂。以時(shí)期分裂和形態(tài)如（圖版1圖 5, 6, 7, 8） o30 r5 0 5 0 52 2 11 nkt2-s.£>弓=09 $注誓訊0曇養(yǎng)34567時(shí)間(day)圖2培養(yǎng)第3代pMSCs分裂指數(shù)曲線Kig.2 The division index curve in cultured cellsof the 3rd >assageo o o8 6 4 gluO>SJH-PV (&)汗出二w20 - /° L / 11-11024681012時(shí)間(hiV <圖3 培昴的第3代pM SC s貼壁率曲線Fig.3 The

15、curve of adhesive rate in cultured cells of the 3rd passage【10】，來自：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)參考（A）相簽顯微鏡下PI、PIC. Pl】、P12. P15和P20MSCs態(tài) 致，址祓形成纖維細(xì) 囲罐R 1；4> PI（1MS（ '< 種二第*氏開始柑拴、相耳癢擅應(yīng)桿狀培構(gòu)f彳曲“電【10】 來自：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究大鼠MSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對(duì)來源于同一動(dòng)物的原代細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5x104/ml。接種到96孔板，每孔接種200卩I細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)（每孔1x104細(xì)胞）。次日起每天選擇 6個(gè)培養(yǎng)孔各自加入 MTT溶液（5mg/ml） 20卩1, 37C繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入150卩IDMSO,室溫振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，于試驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液 的空白對(duì)照1孔。在酶標(biāo)儀上選擇570nm波長，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度（A） 值，連續(xù)測7天，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線?！?1】 來自：多耐藥