糧食中真菌毒素的檢測

1、糧食中真菌毒素的檢測 一、 前言真菌是微生物中的高等生物，是一類有細胞壁，不含葉綠素，無根葉莖，以腐生或寄生方式生存，能進行有性或無性繁殖的微生物。自然界中的真菌分布十分廣泛，并可作為食品中正常菌相的一部分用來加工食品，但在特定情況下又可造成食品的腐敗變質(zhì)。有些真菌本身不僅作為病原體引發(fā)人類疾病，其代謝產(chǎn)物真菌毒素(mycotoxins)也對人及動物造成危害。真菌毒素是農(nóng)產(chǎn)品的主要污染物之一，人畜進食被其污染的糧油食品可導致急、慢性真菌毒素中毒癥。1.1糧食中典型的真菌毒素1）黃曲霉毒素(aflatoxin)主要是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素污染的發(fā)生和程度隨地理和季節(jié)因素以及作物生

2、長、收獲、貯存的條件不同而異，糧油作物在收獲后、貯藏期以及加工后都能受到產(chǎn)毒菌株污染，有時早在作物收獲前就已受到了產(chǎn)毒菌株的污染。1960年在英格蘭南部和東部地區(qū)，十幾萬只火雞因食用發(fā)霉的花生粉而中毒死亡。剖檢中毒死雞，發(fā)現(xiàn)肝臟出血、壞死，腎腫大，病理檢查發(fā)現(xiàn)肝實質(zhì)細胞退行性病變及膽管上皮細胞增生。研究發(fā)現(xiàn)火雞飼料中的花生粉含有一種熒光物質(zhì)，是導致火雞死亡的病因，并證實了該物質(zhì)是黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為黃曲霉毒素。2）赭曲霉毒素最初是從南非的赭曲霉毒株中分離出來的，由赭曲霉(Asper-gillus ochraceus)、洋蔥曲霉(Aspergillus alliaceus)、鮮綠青霉(Pe

3、ncillium viridicatum)、徘徊青霉等代謝產(chǎn)生，包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，赭曲霉毒素A是其中毒性最強的物質(zhì)，是自然界中的主要天然污染物。在一些國家的食品中，赭曲霉毒素A的污染率可達230。該化合物主要表現(xiàn)為腎臟毒性。在巴爾干地方性腎病流行區(qū)，618%人群的血液中能檢出赭曲霉毒素A。3）展青霉毒素(Pat)，又叫棒曲霉毒素和珊瑚青霉毒素，主要是由棒曲霉(Aspergillus clavatus)、擴展青霉(Pencillium expansum)、展青霉(Pencillium patulium)、曲青霉(Pencillium aspergillus)等代謝產(chǎn)生的一種免疫抑制劑。4

4、）單端孢霉烯族化合物是由頭孢菌(ephalosporium)、鐮孢菌(Fusarium)、葡萄狀穗霉(Stachybotrys)和木霉菌(Trichodema)等代謝產(chǎn)生的一組生物活性和化學結(jié)構(gòu)相似的有毒代謝產(chǎn)物。5） 玉米赤霉烯酮(ZEA)又名F一2毒素，是由鐮刀菌屬的菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。最早是由染有赤霉病的玉米中分離得到的，是由禾谷鐮孢(Fusarium gra-minearum)、黃色鐮孢(Fusarium culuorum)、木賊鐮孢(Fusarium eqlliseli)半裸鐮孢(Fusarium semitectum)茄病鐮孢(Fusarium solani)等菌種產(chǎn)生的。許多國家

5、曾報道，豬和牛等家畜攝食被玉米赤霉烯酮污染的谷物或飼料后，可引起動物雌性激素中毒癥。 1.2檢測真菌毒素的常用方法：1）薄層層析法：TLC法是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經(jīng)柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據(jù)熒光斑點的強弱與標準比較測定其最低含量。TLC法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質(zhì)較多，在展開時影響斑點的熒光強度。2）色譜法： 色譜法，包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的真菌毒素的化學分析方法?，F(xiàn)在比較普遍的真菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術。該法快速而準確，但需要

6、昂貴的儀器設備，僅限于專業(yè)檢測機構(gòu)獲得科研和調(diào)查分析、監(jiān)測使用，未能在企業(yè)及基層廣泛推廣使用，而且其結(jié)果的滯后效應大大降低了對生產(chǎn)實際的指導效果。3）免疫化學檢測法： （膠體金免疫層析法，酶聯(lián)免疫吸附法） 免疫學檢測方法是基于抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法。通常具有高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測定，一般可分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、免疫法及電化學免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在飼料霉菌毒素檢測中應用較廣的主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和膠體金免疫層析法。 免疫學檢測方法由于其快速、靈敏、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀

7、器設備，且對樣品純度要求不高等特性，特別適用于飼料廠、糧油/食品加工廠、養(yǎng)殖場等企業(yè)進行原料或成品的檢測以及工商質(zhì)監(jiān)部門現(xiàn)場檢測。該類方法有以下特點：1、靈敏度高2、干擾?。嚎贵w抗原的免疫反應特異性很強，結(jié)構(gòu)類似物、熒光物質(zhì)、有色物質(zhì)對檢測的干擾很小。3、操作簡便快捷：由于特異性強，簡化了樣品的預處理和提取純化過程，同時操作步驟也非常簡便，測定時間也短。4、安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂貴的測定儀器，所用試劑也相對較少，特別是因為靈敏度高，毒素標準品的濃度可以很低，減少了對檢測人員和環(huán)境的潛在危害和污染。二、 實驗目的： 檢測入倉小麥，稻谷，大米的真菌毒素。三、 實驗原理1.免疫膠體金技

8、術(Immune colloidal gold technique) 是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，英文縮寫為:GICT。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。常用的免疫膠體金檢測技術 （1）免疫膠體金光鏡染色法 細胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標記，使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。 （2）斑點免疫金滲濾法 應用微孔濾膜（如膜）作載體，先將抗

9、原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應的抗原或抗體。 （3）膠體金免疫層析法 將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。 2.酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡稱ELISA，采用抗原與抗體的特

10、異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，對受檢物質(zhì)進行定性或定量分析的一種檢測方法。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。（1）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質(zhì)，例如以E.Coli

11、為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。（2）競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越

12、多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結(jié)合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。四、 實驗材料與儀器4.1試樣：小麥，大米，稻谷4.2試劑：超純水（d H2O），甲醇4.3儀器

13、：膠體金真菌毒素檢測卡，酶聯(lián)免疫試劑盒，恒溫箱，酶標儀，移液槍五、 實驗步驟5.1膠體金檢測卡定性測試真菌毒素濃度：1.入倉小麥樣品經(jīng)過糧食分樣器分樣至50g，作為待測樣品。2.把待測樣品經(jīng)植物粉碎機研磨，過20目篩并混勻。3.準確稱取1g均勻粉碎試樣到15mL離心管中。4.在離心管中準確加入萃取液5mL，將瓶塞蓋緊密封，用力震蕩5分鐘，經(jīng)4000rpm離心1分鐘得上清液。5撕開真菌毒素檢測試紙卡包裝,取出金標微孔。用吸管取上述離心管中上清液5滴滴入金標微孔中,2分鐘后用滴管將微孔中的檢測液與金充分混勻,再等2分鐘后,將混勻的混合液用滴管全部吸取并滴加到試紙卡的(S)加樣孔中。6. 510分鐘

14、判斷結(jié)果,半小時后的結(jié)果判讀無效。結(jié)果判定：1測試卡為陰性，表示樣品真菌毒素濃度符合規(guī)定。2測試卡為陽性，表示樣品真菌毒素濃度超過規(guī)定濃度，需要用酶聯(lián)免疫法定量測定其真菌毒素濃度。5.2酶聯(lián)免疫法定量測定真菌毒素濃度：1.入倉小麥樣品經(jīng)過糧食分樣器分樣至50g，把樣品經(jīng)植物粉碎機研磨，過20目篩并混勻。2.準確稱取樣品粉末1g并加于配套的離心管中,加入提取液甲醇-水（4:1）5mL。用震蕩器把提取液和樣品充分混勻并4000rpm離心1分鐘，所得上層液體為含有檢測物質(zhì)的待檢液。3. 根據(jù)需要對待測液進行梯度稀釋；4. 將陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控和標準品作 1：200 稀釋（將5L樣品加稀釋液稀釋到 1

15、mL，混勻） ；5. 取 100L 已稀釋的樣品、標準品和陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控加入相應的孔板內(nèi)（質(zhì)控和標準品至少需做兩孔），A1 孔不加液體作為空白底色；6. 在 37溫箱中放置 30 分鐘；7. 到時間后將孔被液體甩去，并用 1X 洗滌液反復清洗 4 次，最后用蒸餾水洗 一次；8. 在每孔內(nèi)加 100L 酶結(jié)合物（需按比例稀釋，除 A1 孔外），輕微混勻；9. 在 37溫箱中放置 30 分鐘；10. 甩去孔內(nèi)酶結(jié)合物，用 1X 洗滌液反復清洗 4 次，最后用蒸餾水洗一次。11. 在每孔內(nèi)加 100L TMB（使用前混合液和液） 混勻；12. 37放置 15 分鐘，輕微混勻；13. 每孔加 50l 1N 硫酸終止液，終止反應。14. 在 15 分鐘內(nèi)，用酶標儀在 450nm 處讀取吸光度值（OD 值） （將酶標儀 A1 孔設定為空白孔） 。 結(jié)果換算： 以標準樣品的 OD 值為軸，標準樣