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認(rèn)證信息

認(rèn)證類型：個人認(rèn)證

認(rèn)證主體：劉**（實(shí)名認(rèn)證）

IP屬地：天津

IP屬地：天津 上傳時間：2021-12-19 格式：DOC 頁數(shù)：3 大?。?7.50KB 積分：15 舉報 版權(quán)申訴

1、大腸桿菌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀸?shí)驗原理大腸桿菌 DH5e 是基因工程常用的受體細(xì)菌， 在 LB 培養(yǎng)基上生長為白色菌落， 在含有氨 芐青 霉素的培養(yǎng)基上不能生長。 pBR322 質(zhì)粒含有抗氨芐青霉素的基因，轉(zhuǎn)入了 pBR322 質(zhì)粒 的大腸桿 菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上正常生長。目的要求1了解細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的基本過程，進(jìn)一步理解 細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的原理。2觀察大腸桿菌轉(zhuǎn)基因的結(jié)果。材料用具大腸桿菌DH5a質(zhì)粒pBR322或pUCI8等，LB液體和固體培養(yǎng)基，LBA固體培養(yǎng)基。燒杯，試管， Eppendor 管，酒精燈，火柴， 1.5mE 離心管，接種環(huán)，棉花，棉線，記 號 筆，標(biāo)簽，塑料盒，離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒

2、溫培養(yǎng)箱，吸液器，高壓蒸汽滅菌鍋。冰塊，氨芐青霉素（質(zhì)量濃度為100mg/ mi-），物質(zhì)的量濃度為0, 1 mol/ L的CaCI:溶 液，去離子水。方法步驟一、 培養(yǎng)基的配制1 LB 培養(yǎng)基牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0 g瓊脂20.0g將上述物質(zhì)溶解后，用自來水定容至1000mL 配制后，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，用壓力100kPa , 121.3 C, 15? 30min 的條件滅菌后倒平板。2. LBA 培養(yǎng)基將配制好的 LB 培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻至 60 C 左右，加入氨芐青霉素，使氨芐青霉素 最終濃 度為 50mg/ mL 搖勻后倒平板。二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 將大

3、腸桿菌DH5a接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37C恒溫，在搖床上以200r/min的轉(zhuǎn)速 培養(yǎng) 8 h 。2. 取2mL菌液轉(zhuǎn)接于50min。LB培養(yǎng)基中，37C恒溫，在搖床上以 300r/min的轉(zhuǎn)速 培養(yǎng) 約 2 h 。3?將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到min 離心 10min 。4. 除去上清液，用min 離心 10min 。50min 。預(yù)冷的無菌離心管中，在冰上放置10 mL 冰浴的5.0.5h 后即可使用，或者在 三、 轉(zhuǎn)化1. 取200卩L感受態(tài)細(xì)胞，加入冰上放置 30min 后，在 42C 水浴中保溫2.C 保存， 48h10min在 4C 以 4000rCaCl 2 溶液洗滌沉淀，在冰上放置 10min除去上清液，將沉淀懸浮在 2mL 冰浴的 內(nèi)使用。在 4C 以 4 000r CaCl 2溶液中，1? 10 P1 。質(zhì)粒（質(zhì)粒含量不超過 0.1I min ，迅速在冰浴中冷卻 3 5min。每管加入100卩L。液體LBg ），混勻，在培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37C、低于200 r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 45 min 。3. 將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，并將未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌作為對 照實(shí)驗。四、培養(yǎng)將涂布好的平板倒置，于 37 C 培養(yǎng) 12? 16h。