用體外致敏聯(lián)合EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建抗肝癌的人源Fab噬菌體抗體庫

1、用體外致敏聯(lián)合EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建抗肝癌的人源Fab噬菌體抗體庫 作者：水漩，李官成，李躍輝，黃建，趙艷 【摘要】 目的 構(gòu)建抗肝癌的人源Fab噬菌體抗體庫。方法 體外致敏并用EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化肝癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。RTPCR擴(kuò)增人抗體輕鏈和重鏈Fd段基因，將抗體基因分別與載體pComb3連接后，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLIBlue，構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)型Fab抗體庫。結(jié)果 經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的4例肝癌患者PBMC，ELISA檢測均有抗肝癌抗體產(chǎn)生；經(jīng)PCR擴(kuò)增出13條輕鏈基因片段(、)和28條重鏈Fd基因片段()；電轉(zhuǎn)化構(gòu)建的噬菌體抗體庫庫容為1.7×107puf/mL；Fab基

2、因的重組率約為100%。結(jié)論 用體外致敏法結(jié)合噬菌體抗體庫技術(shù)，成功構(gòu)建了全人源抗肝癌Fab組合抗體文庫。 【關(guān)鍵詞】 EB病毒轉(zhuǎn)化；噬菌體抗體庫；肝癌；Fab抗體Construction of phage antibody library using sensitized in vitroBlymphocytes of liver cancer patientsABSTRACT: Objective To construct human phage antibody library against hepatoma carcinoma. Methods Peripheral blood mo

3、nonuclear cells (PBMCs) of patients with liver cancer were sensitized in vitro and transformed by EpsteinBarr virus (EBV). The genes of light chain and Fd of antibodies were amplified by RTPCR. Fab genes were cloned into vector pComb3 and transformed into E.coli XLIBlue by electroporation to constru

4、ct the Fabdisplaying phage antibody library. Results ELISA detection showed that 4 liver cancer patients B cells transformed by EBV could produce specific antibodies to hepatoma carcinoma cell. Totally 13 types of light chain genes and 28 types of Fd genes were obtained by RTPCR. The capacity of the

5、 primary phage library was 1.7×107pfu/mL. The percentage of recombinant clones was about 100%. Conclusion A human phage antibody library has been constructed successfully by means of EBV transformation technique.KEY WORDS: EBV immortalization; phage antibody library; liver cancer; Fab fragment肝

6、癌是一種惡性程度極高的腫瘤。目前，其治療手段仍以手術(shù)切除為首選，但復(fù)發(fā)率極高，且常用的化療藥物對腫瘤的殺傷作用缺乏特異性，常導(dǎo)致明顯的副作用。近年來以抗體為基礎(chǔ)的免疫療法、腫瘤靶向治療和基因治療成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，部分已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室甚至臨床上取得了初步的效果12。利用噬菌體抗體庫技術(shù)，可克服雜交瘤技術(shù)制備人源性單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)的復(fù)雜過程，而且可篩選出多種特異性抗體34。本研究以肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞作為基因來源，聯(lián)合體外致敏和EB病毒(Epstein Barr virus, EBV)轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建全人源的抗肝癌Fab段噬菌體抗體庫，為進(jìn)一步篩選獲得

7、高親和力、高特異性的Fab抗體奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料 肝癌細(xì)胞株HepG2、絨猴淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系B95.8，由本室保存。大腸桿菌XL1Blue、噬菌粒載體pComb3及輔助噬菌體VCSM13均由本室保存。胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)及新生牛血清(newborn calf serum, NBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品；rhIL2、谷氨酰胺、丙酮酸鈉及環(huán)孢菌素A均為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG/M購自Pharmacia Biotech公司；TRIzol為Invitrogen公司

8、產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京百泰克公司；Taq DNA酶、限制性內(nèi)切酶Xba、Sac、Xho和Spe為Fermentas公司產(chǎn)品；T4連接酶為Promega公司產(chǎn)品。20份肝癌患者(經(jīng)病理檢查確診)的外周血標(biāo)本分別采自湖南省腫瘤醫(yī)院和中南大學(xué)湘雅附屬第二醫(yī)院，術(shù)前1d采血。1.2 方法1.2.1 肝癌細(xì)胞抗原的制備 將培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(HepG2)用25g/L胰酶消化并計(jì)數(shù)，按106細(xì)胞加0.5mL絲裂霉素C(1g/L)，于37處理30min，每10min搖動(dòng)一次。用DHanks液洗4次后，加入含10g/L FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，分裝，保

9、存于-20。1.2.2 肝癌患者PBMC的分離 無菌抽取20例肝癌患者外周血各5-8mL，采用密度梯度離心法分離PBMC。用含有50mL/L超級(jí)NBS的DHanks液洗4次，于顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按109個(gè)細(xì)胞/L加入含100ml/L FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含4mmol/L谷氨酰胺和2mmol/L丙酮酸鈉)中，于24孔板中培養(yǎng)。1.2.3 肝癌患者PBMC的致敏 將肝癌患者的PBMC分成兩組：一組用肝癌細(xì)胞抗原致敏，按肝癌細(xì)胞PBMC=110加入PBMC 中，于37培養(yǎng)3-4d后用EBV轉(zhuǎn)化；另一組不用肝癌細(xì)胞抗原致敏，于第2天直接EBV轉(zhuǎn)化。兩組所用培養(yǎng)基均為含10g/L FC

10、S的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含2×104u/L IL2及2mg/L環(huán)孢菌素A)。1.2.4 EBV的轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)B95.8細(xì)胞至對數(shù)生長期，離心、取上清，經(jīng)孔徑為0.22m的濾膜過濾后，收集濾液，保存于-70。PBMC體外致敏后，吸棄每孔中的培養(yǎng)上清，按4×106 PBMC加入1mL EBV培養(yǎng)上清，于37孵育3h，吸棄上清，加入含100mL/L FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，換用含200ml/L NBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基。1.2.5 轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)上清的篩選 采用間接ELISA法。以肝癌細(xì)胞HepG2作為腫瘤細(xì)胞抗原板，經(jīng)15mL/L戊二醛固定

11、10min，用10g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)37封閉2h，PBST洗板5次。分別加入收集的B細(xì)胞培養(yǎng)上清，37孵育2h或4過夜，依次以PBST和PBS洗板各3次，再加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG/M(HRPGAHIgG/M)，于37作用2h后，用2,2連氮雙(3乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)顯色，于波長405nm處測定吸收(A)值。陰性對照為含100mL/L FCS的RPMI1640培養(yǎng)基。陽性閾值為陰性對照孔的A405值(均值)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和。1.2.6 提取總RNA及cDNA第一鏈的合成 將培養(yǎng)上清檢測呈陽性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。用TRIzol試劑

12、分別提取擴(kuò)大培養(yǎng)的B細(xì)胞中的總RNA。混合后，用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA(第一鏈合成)。1.2.7 抗體基因的PCR擴(kuò)增 采用表1中美國Scripps研究所設(shè)計(jì)的引物。以cDNA第一鏈為模板，在TaqDNA酶作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增重鏈Fd部分VH+CH1和輕鏈、鏈的全長基因。PCR擴(kuò)增條件為：94 30s，55 1min，72 1min，共35個(gè)循環(huán)，再于72延伸10min?；厥湛贵w基因并測定其濃度。表1 用于擴(kuò)增人Fab基因的引物（略）Table 1 The primers for amplification of human Fab fragments1.2.8 噬菌體抗體庫的構(gòu)

13、建 取PCR擴(kuò)增的輕鏈抗體基因約500ng及pComb3質(zhì)粒約1g，在150L的酶切體系中，用Sac和Xba于37進(jìn)行雙酶切反應(yīng)4h。酶切產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。將純化的載體和輕鏈基因以適當(dāng)比例混合在室溫下連接過夜，將連接產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1Blue。取少量菌液涂平板鑒定庫容，其余的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增后， 提取質(zhì)粒獲得輕鏈基因質(zhì)粒文庫。以Xho和Spe對重鏈基因的混合物和輕鏈基因質(zhì)粒文庫進(jìn)行酶切，純化后連接并電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1Blue。加入2mL SOC培養(yǎng)液，于37緩慢搖動(dòng)1h后，取少量菌液涂平板鑒定庫容。其余菌液加入到100mL SB培養(yǎng)液內(nèi)(含氨芐青霉素20mg/L及四環(huán)

14、素10mg/L)搖動(dòng)1h，補(bǔ)加Amp至50mg/L，繼續(xù)搖菌2h。加入輔助噬菌體VCSM13 1mL(1012puf)，繼續(xù)搖菌1h，加入卡那霉素至終濃度為70mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。次日，離心收集細(xì)菌培養(yǎng)上清，加入PEG8000(聚乙二醇)和NaCl，至終濃度分別為4%和3%，攪拌溶解置冰浴30min后，于4以15000g離心15min。棄上清，沉淀懸浮于2mL PBS(pH 7.2)內(nèi)，即得噬菌體抗體庫。1.2.9 Fab抗體基因插入率的檢測 隨機(jī)挑取10個(gè)上述轉(zhuǎn)化后的XL1Blue菌落，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用Xab和Xho進(jìn)行雙酶切，鑒定噬菌體DNA輕、重鏈基因的插入率。2 結(jié)果2.1

15、EBV的轉(zhuǎn)化 成功轉(zhuǎn)化4例經(jīng)肝癌細(xì)胞抗原致敏的肝癌患者B細(xì)胞。用肝癌細(xì)胞抗原體外致敏的PBMC培養(yǎng)至6-8d時(shí)，可見集落樣淋巴母細(xì)胞化。在加入EBV上清后，細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)相似，開始可見大量淋巴細(xì)胞死亡。2周左右時(shí)，可見肝癌細(xì)胞抗原致敏組的細(xì)胞有少量克隆生成，主要分布于孔周圍，并逐漸長成團(tuán)(圖1)。4周左右時(shí)，將細(xì)胞加于25cm2的一次性塑料瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，再過4-6周左右收集細(xì)胞。2.2 EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞抗體的檢測 用肝癌細(xì)胞抗原致敏并經(jīng)EBV 轉(zhuǎn)化的4例肝癌患者的PBMC，其培養(yǎng)上清均可檢測出有抗肝癌特異性抗體的產(chǎn)生。而未致敏組培養(yǎng)6-8d后，檢測其上清均為陰性。2.3 RNA的鑒定 抽提4

16、例經(jīng)EBV成功轉(zhuǎn)化的肝癌患者B細(xì)胞的總RNA ，電泳后呈明顯的3條帶(圖2)，即rRNA28s、rRNA18s和rRNA5s，A260/A280值>1.8。說明提取的總RNA質(zhì)量良好。2.4 抗體基因的擴(kuò)增 分別用8對鏈基因引物、5對鏈基因引物和32對重鏈基因引物，擴(kuò)增出8條鏈基因(VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8)、5條鏈基因(V1A、V1S、V2A、V3A、V3B)和28條重鏈基因(3種VH1A、4種VH1F、3種VH2F、4種VH3A、4種VH3F、4種VH4F、3種VH6F和3種VH6A)。重鏈Fd段基因的長度約660bp，輕鏈基因的長度約6

17、60bp。DNA凝膠電泳結(jié)果如圖3、4所示。圖1 EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞（略）Fig.1 EBVtransformed B lymphocytes圖2 從EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞提取總RNA（略）Fig.2 Electrophoresis of total RNA from EBV transformed B lymphocytes2.5 噬菌體抗體庫的建立 將FabpComb3經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)菌XL1Blue。經(jīng)氨芐青霉素及四環(huán)素篩選后，得到庫容約為1.7×107的初級(jí)噬菌體抗體庫。從中隨機(jī)挑取10個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定抗體輕、重鏈基因的插入率。若輕、重鏈共同插入，應(yīng)切出2200bp左

18、右的條帶，酶切結(jié)果如圖5所示，插入率約為100%。3 討論 抗體作為藥物或藥物的運(yùn)載工具，可用于多種疾病的診斷和治療。但鼠源性單克隆抗體(mAb)的免疫原性極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來，隨著噬菌體表面展示技術(shù)的發(fā)展，人們已可制備全人源化的mAb，以克服應(yīng)用鼠抗體的缺點(diǎn)，并具有高活性、低毒性和高成功率的優(yōu)勢，顯示出良好的治療應(yīng)用前景。我們實(shí)驗(yàn)室利用已獲得的噬菌體抗體篩選到兩個(gè)可能為新基因的大腸癌抗原基因5。 圖3 輕鏈基因的PCR擴(kuò)增（略）Fig.3 Cloning immunoglobulin light chain genes by PCRLane M: DL2000 Markers

19、; Lane 1-5(A): VK1d as 3primer, VK1a, VK1s, VK2a, VK3a, VK3b as 5primer; Lane 6-13(B): CL2 as 3primer, VL1, VL2, VL3,VL4,VL5 VL6, VL7, VL8, VL9 as 5primer圖4 重鏈可變區(qū)的PCR擴(kuò)增（略）Fig.4 Cloning immunoglobulin variable region genes of heavy chain by PCRLane M: DL2000 Markers; Lane1-10: The PCR products of dif

20、ferent human Fd chain圖5 重鏈庫插入率的鑒定圖（略）Fig.5 Ratio of Heavy Chain InsertionLane M: DNA/EcoR+Hind Marker; Lane 1-10: Identification of random 10 clones by digestion with Xba/Xho 抗體庫的構(gòu)建是人源抗體制備的關(guān)鍵步驟6，對酶切、連接及轉(zhuǎn)化的各步條件都要認(rèn)真摸索，以盡量增大庫容量。我們發(fā)現(xiàn)在連接時(shí)載體易發(fā)生自連，造成無效克隆，而在載體酶切后對其進(jìn)行去磷酸化，可以提高連接效率，減少無效克隆。另外，在克隆連接過程中通過延長連接時(shí)間，

21、增加連接酶的使用濃度的方法，盡可能地增加連接效率。 在構(gòu)建抗體庫時(shí)我們采用肝癌細(xì)胞抗原對從患者外周血中分離的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，使B細(xì)胞內(nèi)抗體可變區(qū)基因發(fā)生高突變，使其產(chǎn)生特異性抗體的能力獲得提高7，同時(shí)通過EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)使B細(xì)胞永生化，從而可用基因工程技術(shù)大量獲得所需抗體。EBV通過病毒表面蛋白gP350/220與細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體(CR2/CD21)結(jié)合而進(jìn)入被感染的B細(xì)胞，從而使B細(xì)胞能夠在體外連續(xù)傳代，并使數(shù)量較少的抗原特異性B細(xì)胞得到增殖，從而使產(chǎn)生特異性抗體的免疫球蛋白基因得到富集，同時(shí)減少下游基因操作步驟中特異性抗體基因片段VH/VL的丟失，增加VH/VL原始配對的機(jī)率8。

22、通過以上方法，我們構(gòu)建了一個(gè)庫容量達(dá)1.7×107克隆的全人源的Fab抗體庫,酶切鑒定Fab基因的插入率約為100%，為進(jìn)一步用肝癌細(xì)胞篩選特異性抗肝癌Fab抗體奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?；痦?xiàng)目：湖南省衛(wèi)生廳科研基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.A2003001)【參考文獻(xiàn)】 1Hudson PJ, Souriau C. Engineered antibodies J. Nat Med, 2003, 9(1):129134.2Anna Wu, Peter DS. Arming antibodies: prospects and challenges for immuneoconjugates J. Nat Biotech, 2005, 23(9):11371146.3Brissette R, Prendergast JK, Goldstein NI. Identification of cancer targets and therapeutics using phage display J. Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(3):363369.4Pavoni E, Flego M, Dupuis