腺病毒中文操作手冊

1、腺病毒載體操作手冊中文版腺病毒重組系統(tǒng)AdEasyTM 操作手冊第一章 簡介 1第二章 應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn)2第三章 AdEasyTM 技術(shù) 33.1 技術(shù)概況33.2 AdEasyTM 系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程3第四章 主要流程44.1 將基因克隆入AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體44.1.1 克隆的一般原則44.1.2 構(gòu)建重組AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體54.2 細(xì)菌內(nèi)AdEasyTM 重組子的產(chǎn)生54.2.1 共轉(zhuǎn)化的一般原則54.2.2 共轉(zhuǎn)化方法54.2.3 預(yù)期結(jié)果54.3 AdEasyTM 重組質(zhì)粒的篩選和擴(kuò)增64.4 AdEasyTM 重組子轉(zhuǎn)染QBI-293A 細(xì)胞 64.4.1

2、 細(xì)胞鋪板64.4.2 磷酸鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)7第五章 常用技術(shù)85.1 QBI-293A 細(xì)胞培養(yǎng)85.1.1 QBI-293A 細(xì)胞的初始培養(yǎng)85.1.2 QBI-293A 細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖85.1.3 QBI-293A 細(xì)胞的凍存85.2 QBI-293A 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和病毒空斑的產(chǎn)生95.2.1 感染 QBI-293A 細(xì)胞 95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細(xì)胞95.3 MOI 測定 105.4 腺病毒感染力測定105.4.1 X-Gal 染色 11縮寫 英文全稱中文全稱Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清 5 型

3、腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒載體Amp Ampicillin 氨芐青霉素&Gal -Galactosidase -半乳糖普酶bp Base Pair 堿基對錄5.5 重組腺病毒的篩選和純化115.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達(dá)和基因輸送115.5.2 病毒空斑挑選和小量擴(kuò)增125.5.3 Western 雜交 135.5.4 Southern雜交和點(diǎn)雜交 135.5.5 病毒裂解產(chǎn)物PCR 145.5.6 免疫測定145.5.7 功能測定145.6 病毒顆粒在QBI-293A 細(xì)胞中的大量擴(kuò)增155.7 兩次氯化銫密度梯度離心純化重組腺病毒165.7.1

4、不連續(xù)密度梯度離心175.7.2 連續(xù)密度梯度離心175.7.3 病毒溶液去鹽和濃集175.8 病毒滴度測定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑測定法205.8.3 50%組織培養(yǎng)感染劑量法20第六章 疑難解答226.1 QBI-293A 細(xì)胞培養(yǎng)226.2 感染力測定226.3 轉(zhuǎn)移載體克隆236.4 在 BJ5183 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)化和重組246.5 轉(zhuǎn)染 QBI-293A 細(xì)胞 256.6 篩選和測定256.7 在 QBI-293A 細(xì)胞中表達(dá)266.8 重組腺病毒的擴(kuò)增266.9 純化 266.10 病毒滴度測定27BSA Bovine Serum A

5、lbumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互補(bǔ) DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 閉環(huán)螺旋DNACPE Cytopathic Effect 細(xì)胞病理效應(yīng)CsCl Cesium Chloride 氯化銫DMEM Dulbecco s Modified Eagle Medium DMEM 培養(yǎng)基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亞砜DTT Dithiothreitol 二硫蘇糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromid

6、e 溴化乙錠FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小時(shí)ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重復(fù)Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千堿基對KDa KiloDaltons 千道爾頓LB Luria-Bertani ( broth ) LB 培養(yǎng)基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位點(diǎn)Min Minute 分鐘MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染復(fù)數(shù) mRNA Messenger RNA 信使 RNAMWCO MOIecular W

7、eight Cut-off第一章 簡 介PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝膠電泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸鹽緩沖液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成單位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右側(cè)反向末端重復(fù)SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸鈉TBE Tris Borate/EDTA 三羥甲基

8、氨基甲烷硼酸鹽/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50% 組織培養(yǎng)感染劑量TCP Total Cellular Protein 細(xì)胞總蛋白TE Tris/EDTA TE 溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-口引噪-為D-半乳糖普當(dāng)今基因輸送技術(shù)的發(fā)展日趨復(fù)雜，一些治療藥物（生長激素、干擾素、抗病毒和抗癌復(fù)合物）和診斷性蛋白（單克隆抗體）的設(shè)計(jì)、發(fā)展與合成需要更高效的基因輸送工具。人類基因組計(jì)劃和正不斷發(fā)展的基因

9、治療同樣急需發(fā)展快速有效和治療性的分析工具。為解決這一問題，基因輸送技術(shù)（通常使用病毒載體如增殖缺陷的腺病毒）通過基因工程不斷發(fā)展，致力于生產(chǎn)基因表型藥物。重組腺病毒提供了一類在基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)發(fā)展中有極大潛力的新的生物治療劑。1953 年對普通感冒病因的探索和研究導(dǎo)致了腺病毒的發(fā)現(xiàn)。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了40 多種不同血清型和93 種不同種類的腺病毒，它們通常感染眼、呼吸道或胃腸上皮（Fields 等，1996） 。 1977 年， Frank Graham 博士建立了一種細(xì)胞株，可在無輔助病毒的情況下產(chǎn)生重組腺病毒（Graham 等， 1977） 。此后，腺病毒載體作為極具潛力的哺乳動物基因轉(zhuǎn)移載體

10、而得到廣泛應(yīng)用，尤其是在基因治療相關(guān)領(lǐng)域。迄今為止已有大量關(guān)于腺病毒及其應(yīng)用的綜述發(fā)表，我們給感興趣的讀者推薦以下文章： Hitt et al ， 1999和 Wivelet al， 1999。腺病毒亦可被用來在人體細(xì)胞中過量表達(dá)蛋白（Massie et al， 1998 A, B） 。但迄今為止還只有熟知腺病毒的研究人員才會采用腺病毒系統(tǒng)。昆騰生物科技公司是第一個(gè)提供完備而且能廣泛應(yīng)用的重組腺病毒試劑盒Adeno-QuestTM 系統(tǒng)及其相關(guān)產(chǎn)品和客戶服務(wù)的公司，這個(gè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)是在293 細(xì)胞中產(chǎn)生重組腺病毒?，F(xiàn)在介紹的 AdEasyTM 系統(tǒng)以細(xì)菌內(nèi)重組取代哺乳動物細(xì)胞（He et al，

11、 1998） ，使獲得重組腺病毒對任何有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的分子生物實(shí)驗(yàn)室都更方便。重組腺病毒事實(shí)上可在任何細(xì)胞或組織中用來研究表達(dá)重組蛋白。AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體可允許插入7.5kb的外源DNA ,目前正研究腺病毒其它區(qū)的缺失以提高腺病毒在基因治療中的應(yīng)用。這本手冊提供了重組腺病毒技術(shù)中所有必須遵循的原則，并詳細(xì)描述了產(chǎn)生一個(gè)重組腺病毒的所有實(shí)驗(yàn)步驟，包括重組腺病毒在 QBI-293A 細(xì)胞中擴(kuò)增并純化到1012VP 的操作步驟。AdEasyTM 載體系統(tǒng)包含了生產(chǎn)5 型重組腺病毒所需的全部試劑，所有成分購買后即可使用。第二章 應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1. 宿主范圍廣, 對人致病性低這套腺病毒載體

12、系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達(dá)。腺病毒可感染一系列哺乳動物細(xì)胞，因此在大多哺乳動物細(xì)胞和組織中均可用來表達(dá)重組蛋白。2. 在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA 轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對比。3. 能有效進(jìn)行增殖，滴度高這套腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010 到 1011VP/ml ，濃縮后可達(dá)1013VP/ml ，這一特點(diǎn)使它非常適用于基因治療。4. 無需輔助病毒，可容

13、納7.5 kb 外源 DNA： 為提供克隆空間，此腺病毒缺失了E1 和 E3 早期區(qū)。此外，此腺病毒可包裝比正常病毒DNA 稍大的 DNA 分子（ 105%） 。這些特點(diǎn)允許插入腺病毒的基因或多基因表達(dá)盒可達(dá)7.5kb。5. 與人類基因同源該腺病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用了人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，因此為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能。6. 不整合到染色體中，無插入致突變性逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的

14、宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動物的一個(gè)較好的系統(tǒng)。7. 能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增：293 細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293 細(xì)胞可在120L 的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白。8. 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因這是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織中用來設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng)。最簡單的方法是將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來分別表達(dá)一個(gè)蛋白。測定不同重組病毒的MOI 比值可正確估計(jì)各重組蛋白的相對共表達(dá)情況。第三章 AdEasyTM 技術(shù)3.1 技術(shù)概覽AdEasyTM 系統(tǒng)是由T.C.He 等

15、（1998）構(gòu)建的用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)的一個(gè)快捷系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，只需二步即可產(chǎn)生重組腺病毒：先將表達(dá)盒裝入轉(zhuǎn)移載體，然后再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是： 1） 腺病毒 DNA 是大型的線性分子，含有幾乎所有的內(nèi)切酶切位點(diǎn)；2） 基因組過大（ 36kb） ，難于操作。在AdEasyTM載體系統(tǒng)中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質(zhì)粒，而不是線性DNA ,同源重組則在大腸桿菌進(jìn)行。相對于傳統(tǒng)系統(tǒng)而言，這二點(diǎn)改進(jìn)使病毒DNA 操作更容易，同時(shí)由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。在本系統(tǒng)中，首先將基因c

16、DNA 插入一個(gè)轉(zhuǎn)移載體，將得到的質(zhì)粒用PmeI 線性化，然后在大腸桿菌 BJ5183 中與病毒DNA 質(zhì)粒 pAdEasy-1 進(jìn)行同源重組。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 區(qū)，其 E1 區(qū)功能將在293A 細(xì)胞中得到互補(bǔ)。重組子通過卡那霉素篩選，用內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PmeI 線性化，暴露其反向末端重復(fù)序列（ITR， Iaverted Termined Repeats） ，轉(zhuǎn)染QBI-293A 細(xì)胞后產(chǎn)生重組病毒顆粒。同源重組在線性化的轉(zhuǎn)移載體和完整的超螺旋腺病毒質(zhì)粒之間進(jìn)行。應(yīng)用完整的腺病毒質(zhì)粒而不用內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，對于產(chǎn)生重組腺病毒至關(guān)重要。轉(zhuǎn)移載

17、體中的卡那霉素抗性基因則可用來篩選重組子。由于線性化的轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此此同源重組系統(tǒng)有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183 有 recA 活性，但同時(shí)缺失介導(dǎo)細(xì)菌重組的其它酶，具有高效的轉(zhuǎn)化和重組能力。一旦重組子經(jīng)確定，則可轉(zhuǎn)入普通的無recA、endA活性的細(xì)菌株如 DH5c等進(jìn)行擴(kuò)增。由于缺乏recA活性，DH5c不能用于腺病毒的同源重組。3.2 Ad EasyTM 系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，AdEasyTM 系統(tǒng)中篩選和純化腺病毒所需的時(shí)間大大縮短了?？寺『秃Y選約需1-3 周，重組后需驗(yàn)證重組病毒質(zhì)粒是否含有目的基因。重組子在DH5x中擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入

18、哺乳動物細(xì)胞 293A,最后將293A細(xì)胞中產(chǎn)生的重組病毒顆粒進(jìn)行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒只能在提供E1 區(qū)功能的293A 細(xì)胞中進(jìn)行增殖。一般來說，用傳統(tǒng)方法產(chǎn)生重組腺病毒并不需要大量工作，每天只需1 小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代和觀察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個(gè)過程就需要很長時(shí)間。而AdEasyTM 載體系統(tǒng)用大腸桿菌產(chǎn)生重組病毒，大大縮短了所需時(shí)間。我們強(qiáng)烈建議初學(xué)者用QBI-Infect 陽性對照進(jìn)行感染力測定（見5.2.2） 。進(jìn)行這些測定之前，必須先擴(kuò)增QBI-293A 細(xì)胞（見5.5.1 ） 。感染力測定使你能觀察到病毒增殖導(dǎo)致的細(xì)胞表型的改變，獲知你所用細(xì)胞對腺病毒的敏

19、感性，而病毒空斑測定可讓你觀察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 將基因克隆入AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體AdEasyTM系統(tǒng)中有2種轉(zhuǎn)移載體可供進(jìn)行重組腺病毒構(gòu)建：pShuttle和pShuttle-CMV ,這2個(gè)載體都含有多克隆位點(diǎn)（MCS）供插入基因。pShuttle 不含有啟動子和多聚腺苷酸位點(diǎn)（polyA ） ，允許插入含特定啟動子和polyA 位點(diǎn)的表達(dá)盒。pShuttle-CMV 含有單拷貝CMV 啟動子和polyA 位點(diǎn)供基礎(chǔ)表達(dá)和高表達(dá)重組蛋白，你只需將目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位點(diǎn)。表1 提供了各轉(zhuǎn)移載體的特性。表 1 AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體特性

20、載體名稱克隆能力啟動子 polyA 位點(diǎn) 克隆位點(diǎn)線性化位點(diǎn)說明pShuttle 7.5kb MCS 共轉(zhuǎn)化位點(diǎn)PmeI（ ECoRI）轉(zhuǎn)染位點(diǎn)（PacI） 將完整的表達(dá)盒裝入多克隆位點(diǎn)（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共轉(zhuǎn)化位點(diǎn)PmeI（ ECoRI）轉(zhuǎn)染位點(diǎn)（PacI） CMV 啟動子能在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)蛋白4.1.1 克隆的一般原則AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體的特殊設(shè)計(jì)使其極易在克隆中應(yīng)用，但在設(shè)計(jì)克隆策略時(shí)應(yīng)考慮以下因素：1） 在 BJ5183 中進(jìn)行共轉(zhuǎn)化之前必須將轉(zhuǎn)化載體線性化。確證表1 中所列的線性化位點(diǎn)不存在于插入的基因中。注意：在

21、pShuttle 中用 EcoRI 線性化時(shí)，需要用RecA 輔助的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。如果插入基因含有所有線性化酶切位點(diǎn)，那么必須進(jìn)行定向突變。2） 重組腺病毒質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染QBI-293A 細(xì)胞之前也必須用PacI 進(jìn)行線性化。同樣，插入基因中不能含有PacI 位點(diǎn)，如果有則必須進(jìn)行定向突變。3） 克隆能力是指質(zhì)粒載體能夠克隆并且不影響病毒增殖能力的插入基因的最大長度。各轉(zhuǎn)移載體的克隆能力見表1，建議插入基因的長度最好不超過它的上限。在pShuttle 和 pShuttle-CMV 中分別插入大于7.5kb 和 6.6kb 的基因?qū)⒋蟠蠼档驼麄€(gè)系統(tǒng)的效率。盡管也可能得到重組子，但可能會發(fā)生D

22、NA 重排，生長速度也將減慢。4） 如果要插入多個(gè)表達(dá)盒，應(yīng)避免以頭對頭方向插入相同的元件（如CMV 啟動子） ，否則同源重組時(shí)兩個(gè)元件之間的部分可能會發(fā)生丟失。5） 在進(jìn)行構(gòu)建腺病毒之前最好測定重組蛋白的暫時(shí)性表達(dá)。這里沒有提供詳細(xì)的操作方法，但在CMV 或其它強(qiáng)力啟動子控制下的基因很容易進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)實(shí)驗(yàn)。但某些啟動子控制下的蛋白表達(dá)水平在無病毒增殖時(shí)可能不足以達(dá)到檢測水平。6） 載體 DNA 可用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心或親和柱法進(jìn)行純化。我們不主張用小量粗制的DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槲廴镜腄NA 將大大降低菌落和空斑的形成數(shù)。4.1.2 構(gòu)建重組AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體

23、構(gòu)建重組AdEasyTM 轉(zhuǎn)移載體的一般指導(dǎo)如下，但我們建議對于詳細(xì)的克隆技術(shù)和操作方法還需參考通用的分子生物學(xué)手冊。1 若 cDNA 含有位置正確的粘性內(nèi)切酶位點(diǎn)，則可將它直接克隆入轉(zhuǎn)移載體。如果沒有，可以使用鈍末端內(nèi)切酶位點(diǎn)，也可用含合適的酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR 或連接含有酶切位點(diǎn)的接頭使cDNA 產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。PCR 插入酶切位點(diǎn)的方法較快速，但對于長cDNA 則應(yīng)使用連接接頭，因?yàn)樵跀U(kuò)增過程中Taq 酶可能會使序列的某些位點(diǎn)發(fā)生突變。2 插入基因的鑒定可以用限制性內(nèi)切酶分析或PCR 的方法。3 轉(zhuǎn)化之前用PmeI 或 EcoRI 將轉(zhuǎn)移載體重組子線性化，消化應(yīng)盡可能徹底，以減少背

24、景信號。4 瓊脂糖凝膠上觀察消化產(chǎn)物，若消化已完全，放入6520 分鐘進(jìn)行滅活。5 凝膠純化線性化載體。盡管膠純化可能會降低轉(zhuǎn)化效率，但不完全消化往往產(chǎn)生較高的背景，從而降低重組率。將線性化質(zhì)粒去磷酸化也有助于降低背景信號。6 重懸純化的DNA ,濃度至少為0.2ug/ul。每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取1ug進(jìn)行，包括對照。4.2 細(xì)菌內(nèi) AdEasyTM 重組子的產(chǎn)生4.2.1 共轉(zhuǎn)染的一般原則1） 將線性化轉(zhuǎn)移載體和pAdEasyTM-1 DNA 共轉(zhuǎn)化 BJ5183 必須要用高活性的感受態(tài)細(xì)胞。試劑盒中提供的細(xì)菌為電穿孔感受態(tài)，有很高的轉(zhuǎn)化效率。如果不用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，那么必須制備化學(xué)敏感性感受態(tài)細(xì)

25、胞，并在應(yīng)用之前試驗(yàn)其轉(zhuǎn) 化活性（108 已足夠） 。2） DH5a不可用于轉(zhuǎn)化，因其不支持重組，它只是用來擴(kuò)增重組病毒DNA。3） 本實(shí)驗(yàn)需要2ug 線性化膠純化的重組轉(zhuǎn)移載體，共轉(zhuǎn)化和對照各需1ug。4.2.2 共轉(zhuǎn)化方法同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對照組的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組共轉(zhuǎn)化：1ug線性化重組轉(zhuǎn)移載體（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1載體（100ug/ul）對照組車t化：1ug （5ul）線性化重組轉(zhuǎn)移載體1 將 BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞和電穿孔杯置于冰上。將細(xì)胞分為2 管，每管40ul。2 . 40ul感受態(tài)細(xì)胞中至多加入 6ul DNA ,且DNA必須溶于水，避免含有離子。3 .將

26、BJ5183轉(zhuǎn)入2mm電穿孔杯，防止有氣泡形成。4 .按電穿孔供應(yīng)商的使用說明轉(zhuǎn)化BJ5183, Bio-Rad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2.5KV ; BTX儀器則為：5 Ohms、2.5KV、C=0。5 . 用1mlLB重懸轉(zhuǎn)化物。6 . 轉(zhuǎn)入1550ml離心管中，37c震蕩培養(yǎng) 60分鐘。7 .將轉(zhuǎn)化物鋪35塊LB/Kan (50ug/ml)培養(yǎng)板，37c培養(yǎng)24小時(shí)。建議分別鋪 100、300和600ul,以提高至少在一 塊板中得到可分離菌落的機(jī)率，應(yīng)該得到40100個(gè)菌落。8 .挑出24個(gè)最好的克隆，轉(zhuǎn)入 2ml LB/Kan (50ug/ml)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1

27、015個(gè)小時(shí)。不要儲存 BJ5183培養(yǎng)液，因有可 能產(chǎn)生非目的重組子。盡快抽提重組AdEasyTM質(zhì)粒。9 .用傳統(tǒng)堿裂解法小量制備質(zhì)粒，取一半進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證超螺旋質(zhì)粒的大小。玻璃珠或樹脂制備質(zhì)粒的試劑盒應(yīng)避免使用，但粘粒 DNA抽提試劑盒可以用。重組質(zhì)粒大小約40kb,由于它是低拷貝質(zhì)粒，所以小量制備時(shí)應(yīng)相應(yīng)調(diào)整具體操作。4.2.3預(yù)期結(jié)果20%以上的菌落應(yīng)含有大質(zhì)粒(近40kb),這些是侯選重組子。與對照培養(yǎng)板生長的菌落進(jìn)行對照即可大概估計(jì)線性化轉(zhuǎn)移載體再連接所致的背景強(qiáng)弱。由于在此高效重組recA+細(xì)菌中重組轉(zhuǎn)移載體會形成多聚體，因此背景將表現(xiàn)為一個(gè)梯度。4.3 Ad

28、EasyTM重組質(zhì)粒的篩選和擴(kuò)增將侯選重組子進(jìn)行酶切分析，驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。比如：PacI酶切后通常得到約 30kb的片段和一個(gè)3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重組位置在左臂還是復(fù)制子而不同。建議同時(shí)用克隆基因的內(nèi)切酶進(jìn)行分析，鑒定是否含有插入基因。挑選最佳陽性重組子轉(zhuǎn)入 DH5x中進(jìn)行擴(kuò)增：轉(zhuǎn)化 DH5x只需1-5ul小量制備的重組子。這一步對于擴(kuò)增時(shí)保持重組DNA的結(jié)構(gòu)是必需的，因?yàn)?AdEasyTM這樣的大質(zhì)粒在recA+細(xì)菌株如BJ5183中是不穩(wěn)定的，會迅速出現(xiàn)缺失 ，而在DH5x中能很容 易地獲得大量DNA。1 .將DH5a感受態(tài)細(xì)胞和電穿孔杯置于冰上。2 .將1-5ul DN

29、A加入40ul DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，DNA必須用水溶，避免含有離子。3 .將DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入2mm電穿孔杯，防止形成氣泡。4 . 按照說明轉(zhuǎn)化 DH5a : Bio-Rad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2.5KV ; BTX儀器則為：50 Ohms、2.5KV、C = 0o5 .將轉(zhuǎn)化混合液重懸于1ml LB中。6 . 轉(zhuǎn)入15-50ml離心管中，37c振蕩培養(yǎng)60分鐘。7 .培養(yǎng)后用LB按一定梯度稀釋轉(zhuǎn)化的 DH5a (1:10、1:100和1:1000)8 .取100ul轉(zhuǎn)化液鋪在LB/Kan (50ug/ml)板上，37c培養(yǎng)24小時(shí)。未用的轉(zhuǎn)化液可在 4c

30、保存-2周。9 .每個(gè)重組子挑13個(gè)克隆轉(zhuǎn)入5ml LB擴(kuò)增，以備有足夠量質(zhì)粒。這時(shí)，用內(nèi)切酶再次分析重組DNA ,以確證含有插入基因，以及重組子的穩(wěn)定性。10 .用柱純化試劑盒制備至少 5ug高質(zhì)量的重組 DNA。11 .取5ug質(zhì)粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在無菌條件下溶于50ul 0.1kE溶液。具體要求參見磷酸鈣技術(shù)一章中有關(guān)轉(zhuǎn)染前 DNA制備的內(nèi)容。4.4 AdEasyTM 重組子轉(zhuǎn)染 QBI-293A 細(xì)胞注意：培養(yǎng)細(xì)胞前先參閱 5.1章中有關(guān)QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)容。磷酸鈣技術(shù)中的注意點(diǎn)：無菌在整個(gè)過程中保持所有成分的無菌是至關(guān)重要的。昆騰公司提供的試劑盒

31、中所有成分均是無菌的，但使用者還必須保證所 用其它試劑也均為無菌。DNA純度磷酸鈣轉(zhuǎn)染中所用的 DNA必須是高純度的，一些DNA污染物對培養(yǎng)的細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往會被污染物殺死。沉淀時(shí)間以前的資料都建議磷酸鈣-DNA共沉淀顆粒在加入細(xì)胞和培養(yǎng)液之前至少應(yīng)反應(yīng)20分鐘。然而與此相反，最近的研究(Jordan等，1996)顯示長時(shí)間共沉淀會形成聚合沉淀塊，從而降低轉(zhuǎn)染效率。因此，建議共沉淀成分混合后1分鐘即可 將沉淀加入細(xì)胞培養(yǎng)板。這一時(shí)間上的調(diào)整可產(chǎn)生小而穩(wěn)定的沉淀，能更有效地被細(xì)胞攝入。4.4.1 細(xì)胞鋪板每塊板都用DMEM5%進(jìn)行培養(yǎng)，這樣細(xì)胞在鋪板后第二天即可達(dá)到70

32、%匯合率。由于共轉(zhuǎn)染是通過細(xì)胞表面完成的，因此轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞必須是分離的，而不是匯合的。1 .轉(zhuǎn)染前一天以 7.5X05 QBI-293A細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中鋪板，用DMEM5%培養(yǎng)，第二天的細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到 1.01.5博6。37 C CO2孵箱中培養(yǎng)。CO2孵箱有助于保持合適的 PH,培養(yǎng)皿在不進(jìn)行操作時(shí)必須始終保存在CO2孵箱中。2 .轉(zhuǎn)染前3-4小時(shí)換成新鮮培養(yǎng)液，以保證在轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞具有超常的生長力。將培養(yǎng)皿放回CO2孵箱中。3 .4.2磷酸鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)1 .每個(gè)轉(zhuǎn)染都必須用5ug無菌的線性化重組腺病毒 DNA o2 .標(biāo)記一個(gè)1.5ml離心管為編號1。用微量移液槍加入 169ul無菌水和

33、5ul 2M氯化鈣溶液。上下吸打二次混勻，然后一 滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化鈣，再用移液槍慢慢吹打混勻。此時(shí)緩沖液的體積為 250ul ,含有0.25M氯化鈣和5ug DNA。3 .準(zhǔn)備第2管離心管（編號2）,加入250ul 2 HBS緩沖液。4 .用1ml移液槍吹打2號管中的溶液形成氣泡，在吹打的同時(shí)逐滴加入1號管的溶液。加完后繼續(xù)吹打5秒以使其完全混勻。這一步驟對于形成的共沉淀顆粒的大小至關(guān)重要，小顆粒轉(zhuǎn)染效率更高，而吹打可以形成較小的顆粒。等一分鐘后再加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。5 .在超凈臺內(nèi)將磷酸鈣-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培養(yǎng)皿中，覆蓋范圍盡可能廣。培養(yǎng)液

34、稍后即會透明，十字形晃 動培養(yǎng)皿使沉淀均勻分布。6 .培養(yǎng)皿放入孵箱培養(yǎng)過夜。4小時(shí)后，沉淀顆粒在 200M到置顯微鏡下應(yīng)清晰可見，尤其在無細(xì)胞的培養(yǎng)皿表面。7 .第二天，去除含共沉淀顆粒的培養(yǎng)液，用 PBS制備的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞都十分脆弱，容易脫壁。清洗時(shí)應(yīng)十分輕柔，將PBS沿培養(yǎng)皿壁加入，然后輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿。用移液槍反復(fù)將培養(yǎng)液直接加在細(xì)胞上，即可使細(xì)胞脫落，然后收集。由于這一時(shí)期細(xì)胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 . 將細(xì)胞分裝入 4個(gè)60mm培養(yǎng)皿（每個(gè)培養(yǎng)皿中加 5ml DMEM5% ）或一塊6孔板中（每孔加 3ml DMEM5% ）,靜置6

35、 小時(shí)使其貼壁。6小時(shí)后覆蓋瓊脂糖以供形成病毒空斑。第五章常用技術(shù)5.1 QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng)昆騰公司的293A細(xì)胞來源于一個(gè)用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉(zhuǎn)染的特性。該細(xì)胞株對于高細(xì)胞密度很敏感，當(dāng)細(xì)胞超過70%匯合時(shí)，一些細(xì)胞可能會丟失它們的表型。若細(xì)胞密度持續(xù)在 70%以下，QBI-293A細(xì)胞則能連續(xù)培養(yǎng)34個(gè)月維持原有細(xì)胞特性。若以購買得到的293作為第一代，則30代內(nèi)能得到最佳結(jié)果。一旦到了 30代，最好復(fù)蘇一管細(xì)胞開始新的培養(yǎng)。所以，我們建議你在收到細(xì)胞后應(yīng)盡快建立自己的QBI-293A細(xì)胞庫。QBI-293A細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)液還含有4.5g/L L-

36、葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清濃度為2%10%,視實(shí)驗(yàn)需要來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長速度。為簡化此操作說明，培養(yǎng)基描述為DMEM后加血清濃度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、終濃度為2mM的谷氨酰胺和終濃度為 5%的熱滅活胎牛血清）。QBI-293A細(xì)胞需按標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行操作，在健康狀態(tài)時(shí)，它們呈成纖維細(xì)胞樣并在培養(yǎng)瓶中貼壁形成單層細(xì)胞。被感染的細(xì)胞則變圓脫落，即所謂的細(xì)胞病理效應(yīng)（ CPE）。所有的細(xì)胞培養(yǎng)操作都應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌原則，這一點(diǎn)是至關(guān)重要的?？股乜捎每刹挥?，但無抗生素條件對于操作質(zhì)量來說通常是一個(gè)好的對照。Q

37、BI-293A細(xì)胞生長的相對密度見下表：表2：匯合率與細(xì)胞數(shù)量匯合率 （） 60mm培養(yǎng)皿100mm培養(yǎng)皿50 1.60 106 3.5 W675 2.40 106 5.25 W6100 3.20 106 7.00 W65.1.1 QBI-293A細(xì)胞初始培養(yǎng)1 .將凍存的一管QBI-293A細(xì)胞在37 c水浴輕輕晃動融化。2 .融化后在超凈臺無菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。3 .將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管中，加入 10mL DMEM 10% , 600 xg離心5分鐘使細(xì)胞沉淀。4 .棄去上清。5 .將細(xì)月用10mL DMEM 10% 重懸，輕輕打勻6 .轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶

38、或100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。7 .在5% CO2孵箱中37c培養(yǎng)過夜。8 .第二天觀察細(xì)胞匯合率，若合適則可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則按5.1.2所述繼續(xù)培養(yǎng)。9 .1.2 QBI-293A細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖QBI-293A細(xì)胞必須按1:10至（1:20傳代1 .室溫下胰酶消化13分鐘使貼壁細(xì)胞脫落2 .拍打培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞脫落，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，是否已從培養(yǎng)瓶表面脫落。3 .按需要用新鮮培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。在5% FBS中，細(xì)胞倍增的時(shí)間是 26小時(shí)，在10% FBS中稍短一些。5.1.3 QBI-293A細(xì)胞的凍存建立細(xì)胞庫時(shí)必須使培養(yǎng)的細(xì)胞匯合率低于50% ,以保證亞

39、克隆的特定表型。1 . QBI-293A細(xì)胞必須在含 10%高質(zhì)量FBS的DMEM 中培養(yǎng)。2 .將健康生長的QBI-293A細(xì)胞離心沉淀。3 .以最小體積的DMEM 10%重懸細(xì)胞。4 .用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。5 .用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS 重懸細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為 1 X106/mL。6 .無菌操作將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2mL凍存管中。7 .將凍存管放入凍存盒中，-80C儲存24小時(shí)。這一簡便措施可保持約1C/分鐘的降溫速率，適于凍存細(xì)胞。8 .第二天將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐或 -150 C冰箱中長期保存。QBI-293A細(xì)胞若正確凍存，則可在液氮罐中保存數(shù)年

40、。5.2 QBI-293A細(xì)胞的感染和病毒空斑的產(chǎn)生感染QBI-293A細(xì)胞和產(chǎn)生病毒空斑在這本手冊的多種操作中都得到應(yīng)用，其具體操作視不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩杂胁町悾ㄈ?滴度測定、大規(guī)模擴(kuò)增和純化）。這一節(jié)提供了一個(gè)基本的操作說明，并詳細(xì)描述了QBI-293A細(xì)胞感染后不同時(shí)間的具體變化。5.2.1 感染 QBI-293A 細(xì)胞QBI-293A細(xì)胞中腺病毒的感染周期表現(xiàn)為光鏡下可見的細(xì)胞表型的改變，此周期始于病毒和細(xì)胞接觸后。被感染細(xì)胞的 表型變化與病毒接觸的時(shí)間以及病毒細(xì)胞比率相關(guān)，這個(gè)比率稱為感染復(fù)數(shù) （MOI）。病毒控制細(xì)胞并阻止細(xì)胞的生長需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間。1020的MOI值通常用于需要同

41、時(shí)感染所有細(xì)胞時(shí)，此時(shí)細(xì)胞匯合率應(yīng)該在9095%左右，因?yàn)榧?xì)胞在感染數(shù)小時(shí)內(nèi)將停止生長。加入病毒的量可通過MOI值測定（見5.3）或病毒滴度測定（見 5.8）確定。在這個(gè) MOI值條件下，被感染細(xì)胞的形態(tài)在12天后就會完全改變：細(xì)胞變圓并逐漸從壁上脫落（見5.2.2）。隨著病毒的增殖，細(xì)胞核將占據(jù)細(xì)胞的大部分，這一表現(xiàn)稱為細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE）。感染后3天，所有細(xì)胞都將呈現(xiàn) CPE。當(dāng)QBI-293A細(xì)胞在MOI值為1或更低的情況下被感染，則只有一部分細(xì)胞能被感染。此時(shí)感染所有的細(xì)胞必須產(chǎn)生完整 的感染周期并釋放病毒，整個(gè)過程大概需要 4天。在這個(gè)過程中，未被感染的細(xì)胞將繼續(xù)生長，細(xì)胞可能在未

42、被全部感染時(shí)達(dá)到100%匯合率而停止生長。感染后的表現(xiàn)是多種多樣的，但典型的表現(xiàn)是在感染后5天可見大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn) CPE而其余的細(xì)胞表現(xiàn)為原來未被感染的形態(tài)。感染的操作很簡單，只要將病毒與細(xì)胞接觸。為增加感染的有效性，在最初2小時(shí)感染中最好將培養(yǎng)液的體積減到最小，這樣病毒與細(xì)胞接觸得會更緊密，然后再增加培養(yǎng)液。止匕外，緩慢而持續(xù)地晃動培養(yǎng)板（Mittereder et al. 1996 ）可使病毒分布更均勻，從而使感染效果更好。注意：處理細(xì)胞和病毒時(shí)都必須使用消毒的槍頭。5.2.2 病毒空斑形成病毒空斑形成源于一個(gè)細(xì)胞被一個(gè)病毒感染后，經(jīng)過多次完整的感染周期釋放病毒再感染周圍的細(xì)胞。病毒空斑的

43、形成是一個(gè)緩慢的過程，甚至在光鏡下能觀察到空斑之前，細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到 100%匯合。為限制病毒的擴(kuò)散，通常在培養(yǎng)液中加入 瓊脂糖，但在瓊脂糖覆蓋下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變則要稍微困難一些。感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，表現(xiàn)為一定區(qū)域內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)CPE。第10天可以在光鏡下看到形態(tài)完整的空斑，有經(jīng)驗(yàn)的研究者則能憑肉眼觀察到培養(yǎng)板底部有小的空白斑點(diǎn)形成。到 14天，空斑可非常容易地被挑選出來。5.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細(xì)胞將瓊脂糖覆蓋細(xì)胞不是一項(xiàng)容易的技術(shù)，你必須在瓊脂糖凝固之前迅速地將它在單層細(xì)胞上完全鋪勻。但是如果鋪得太快 太重，那么細(xì)胞往往會脫壁。但通過幾次實(shí)驗(yàn)后，這一步應(yīng)該比較容易了。瓊

44、脂糖/DMEM混合物制備：1 .用無菌PBS制備5% SeaPlaque瓊脂糖（FMC產(chǎn)品）儲存液，高壓消毒后每管 10mL分裝在50mL塑料離心管中，4c保 存。2 .使用之前先在微波爐中融化 5% SeaPlaque瓊脂糖（避免沸騰），然后冷至45 C。防止瓊脂糖沸騰最好的辦法是在沸水浴 中加熱，如果沒有完全融化的話再在微波爐中加熱數(shù)秒。3 .加入30mL預(yù)平衡至37c的DMEM5% 后充分混勻，這樣瓊脂糖的終濃度為1.25%。立即使用。覆蓋QBI-293A細(xì)胞：在進(jìn)行下一步操作之前，請確認(rèn)細(xì)胞是否已貼壁完好。1 .移去培養(yǎng)液，用1.25%瓊脂糖/DMEM混合物覆蓋單層細(xì)胞。2 .沿著培養(yǎng)

45、板的邊緣將瓊脂糖輕輕加入，加入的具體體積參考表3,然后放回CO2孵箱培養(yǎng)。表3:不同培養(yǎng)器皿應(yīng)用的瓊脂糖體積 培養(yǎng)皿大小首次量追加量100 mm 10 mL 5 mL60 mm 5 mL 3 mL6 孔板 3 mL 1.5 mL空斑應(yīng)在1021天內(nèi)形成，為保持細(xì)胞活力，每45天或培養(yǎng)基變黃時(shí)追加瓊脂糖 /DMEM混合物。5.3 MOI 測定一這一實(shí)驗(yàn)用來粗略估計(jì)病毒上清中病毒顆粒的數(shù)量（精確測定病毒顆粒數(shù)量見 5.8節(jié)的滴度測定）0MOI測定通常在擴(kuò)增病毒尤其是在大量擴(kuò)增的時(shí)候使用，以確定感染的最佳條件。這一實(shí)驗(yàn)可在含有1X106QBI-293A細(xì)胞/孔的6孔板中進(jìn)行。1 .移去培養(yǎng)液，每孔加

46、入 500 VL新鮮的培養(yǎng)液2 . 一孔為對照，其余每孔分別加入2、5、10、25、50 VL病毒上清。3 .不斷緩慢晃動培養(yǎng)板，培養(yǎng)約 3小時(shí)。4 .加入1.5mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 72小時(shí)。觀察每孔細(xì)胞是否出現(xiàn) CPE,根據(jù)預(yù)先的估計(jì)，感染后 3天細(xì)胞完全出現(xiàn) CPE的病毒MOI值為1020。這樣，根據(jù)感染 的細(xì)胞數(shù)量，你就可以估計(jì)出上清中的病毒量。5 .4腺病毒感染力測定這一實(shí)驗(yàn)的目的是確定腺病毒是否能將DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入293之外的某一細(xì)胞株。該實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘⒋_定腺病毒是否可應(yīng)用于這個(gè)細(xì)胞株，以及如果能應(yīng)用則需要多少的病毒量（也就是需要大量擴(kuò)增的程度）來完成整個(gè)研究。這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，如果用

47、的是Ad5-CMV-LacZ則檢測3半乳糖普酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP則檢測GFP。這些高滴度的產(chǎn)品都 可單獨(dú)向昆騰公司購買。本實(shí)驗(yàn)的陽性對照（3半乳糖普酶檢測）亦可向昆騰公司購買，但由于病毒滴度太低而不適于直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通常需要擴(kuò)增以達(dá)到理想的病毒滴度（擴(kuò)增步驟見5.6）。腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率各個(gè)細(xì)胞株都不太一樣，其中尤以淋巴細(xì)胞株最難轉(zhuǎn)導(dǎo)。腺病毒感染力測定通常在多孔板中進(jìn)行，MOI為1200,當(dāng)測定淋巴細(xì)胞株時(shí) MOI可至1000。對大多數(shù)細(xì)月株來說，150的MOI值可將報(bào)告基因轉(zhuǎn)入所有的細(xì)胞而不會出現(xiàn)任何的毒性。在高 MOI情況下，某些病毒蛋白的高表達(dá)可對某些細(xì)胞

48、產(chǎn)生毒性。無論 MOI為多少，感染時(shí)都必須用最小的培養(yǎng)液體積并不斷晃動，以使感染效果達(dá)到最佳。1 .按5.2.1中所述方法在6孔板中用不同數(shù)量病毒感染細(xì)胞（合適的MOI范圍），培養(yǎng)48小時(shí)。2 .進(jìn)彳f X-gal染色（見下述）。注意細(xì)胞與病毒培養(yǎng)后不必清洗細(xì)胞，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中讓病毒留在培養(yǎng)液中。5.4.1 X-gal 染色1 .棄去培養(yǎng)液，用37c預(yù)熱的PBS沖洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆蓋細(xì)胞，0.05%戊二醛室溫孵育515分鐘或2%多聚甲醛室溫孵育 60分鐘。2 .棄去固定液，室溫下用 PBS徹底洗3遍：第一遍將沖洗液立刻棄去，第二、第三遍則讓沖洗液保留5分鐘。3

49、 .加入最小體積的X-gal溶液。4 . 37c孵育1至12小時(shí)（過夜），陽性細(xì)胞將被染成藍(lán)色。染色完成后可將培養(yǎng)板置于4c保存。溶液：a）戊二醛固定液使用前將戊二醛用 PBS稀釋至終濃度為0.05% b)多聚甲醛固定液1 .將2g多聚甲醛溶解在50mL預(yù)熱至55c的水中。2 .加入2滴10 N NaOH ,溶液將變澄清。3 .待多聚甲醛溶解后，加入 10mL 0.2M 磷酸二氫鈉(2.76g/100mL)和40mL 0.2M 磷酸氫二鈉(無水，3g/100mL)。4 .固定液在37c條件下加入，在室溫下固定。多聚甲醛固定液可在4c最長保存一個(gè)星期。c) X-gal 溶液用 PBS 制備(PH

50、7.4):20 mM 富鐵酸鉀(K3Fe(CN)6 )20 mM 富亞鐵酸鉀 (K4Fe(CN)6?3H2O )2 mM MgCl2 或 MgSO4使用前加入X-gal儲存?( 20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺),終濃度為1mg/mL。上述三種X-gal染色用的溶液可在室溫下保存數(shù)月，溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal儲存液則可于-20C在玻璃容器中儲存，用箔包裹后避光保存。5.5重組腺病毒的篩選和純丁-腺病毒轉(zhuǎn)移載體和腺病毒 DNA通過在體同源重組產(chǎn)生重組腺病毒，這涉及到復(fù)雜的反應(yīng)和基因重排或突變，導(dǎo)致病毒呈 現(xiàn)不同的表型。雖然重組腺病毒 DNA在細(xì)菌內(nèi)重組后已篩選到含有插入基因，但

51、我們還是建議按照下面的操作步驟對細(xì) 胞內(nèi)產(chǎn)生的重組腺病毒進(jìn)行鑒定。5.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達(dá)和基因輸送重組腺病毒的挑選取決于病毒表達(dá)蛋白和增殖的能力。比如有兩個(gè)不同特性的克隆，第一個(gè)克隆蛋白表達(dá)很好而且病毒可增殖至5000VP/細(xì)胞，而第二個(gè)克隆雖然蛋白表達(dá)水平只達(dá)到第一個(gè)克隆的75%,但是卻可以增殖到10000VP/細(xì)胞。擴(kuò)增的時(shí)候，第二個(gè)克隆10L產(chǎn)量中的病毒數(shù)量即可達(dá)到第一個(gè)克隆20L的產(chǎn)量，這樣當(dāng)需要大量擴(kuò)增病毒時(shí)第二個(gè)克隆是較好的選擇，而且產(chǎn)物足以產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，。篩選方法的選擇取決于病毒最終的應(yīng)用。如果用于蛋白表達(dá)，那么必須使用能監(jiān)測蛋白表達(dá)水平的方法；如果要挑選能有 效

52、擴(kuò)增的克隆，那么就用能定量檢測DNA產(chǎn)量的方法。簡單的重組腺病毒篩選可用 PCR方法，這一技術(shù)只檢測病毒中的重組DNA ,而不能篩選特定的表型。其它技術(shù)不但能篩選重組病毒，同時(shí)也能挑選特定的表型?？寺〉奶暨x可根據(jù)：1 .每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生病毒的數(shù)量。這可以用Southern雜交的方法，因?yàn)椴《?DNA量與每個(gè)細(xì)胞的病毒含量有關(guān)。能產(chǎn)生高水平病毒量的克隆有利于生產(chǎn)高滴度的病毒儲存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表達(dá)蛋白。2 .每個(gè)細(xì)胞蛋白表達(dá)的水平。這可以用Western雜交或功能測定的方法。請注意有些最佳克隆可能會較難培養(yǎng)。因此篩選方法的選擇取決于用來觀察生物學(xué)效應(yīng)的蛋白表達(dá)水平和重組腺病毒的最

53、終應(yīng)用。表4提供了選擇最佳篩選方法的向?qū)А?bào)告基因、表達(dá)蛋白的抗體和功能測定的敏感性將影響操作方法的選擇。得到最初結(jié)果的時(shí)間對方法的選擇也很重要，但這一原則必須慎重考慮，因?yàn)槿绻罱K目的是生產(chǎn)大量病毒，那么一個(gè)10倍量高產(chǎn)的克隆只需擴(kuò)增1L即能達(dá)到原來10L的病毒量，這時(shí)使用快速篩選方法所節(jié)省的時(shí)間會在大量擴(kuò)增過程中完全耗費(fèi)掉。表4:各種篩選方法的特性篩選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)Western雜交逐示表達(dá)蛋白的完整性瑜示插入基因的蛋白表達(dá)水平0需要表達(dá)蛋白的抗體 可以用與其它蛋白有交叉反應(yīng)的抗體，因?yàn)榈鞍讜谀z上得到分離V'得到最終結(jié)果需兩個(gè)星期Southern 雜交或點(diǎn)雜交 4使用克隆基因作為探

54、針，無須特殊試劑通過信號強(qiáng)弱間接測定每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量年需從病毒儲存液中額外擴(kuò)增，整個(gè)流程需要一周時(shí)間Y雙能檢測克隆的基因pcrY迅速，使用擴(kuò)增病毒的儲存液只需1天時(shí)間 苗又能檢測克隆的基因且無法定量%；能需要優(yōu)化克隆基因的 PCR條件免疫測定畬目對快速，總共需要 3天時(shí)間'需要與細(xì)胞蛋白無交叉反應(yīng)的特異性抗體?顯示插入基因的蛋白表達(dá)水平功能測定丫直接顯示蛋白的完整性和功能疆從病毒儲存液中額外擴(kuò)增，整個(gè)流程需要一周時(shí)間對于大多數(shù)方法來說，信號密度與蛋白的表達(dá)水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的純度有關(guān)?？瞻呖偭恐械年栃月侍崾究寺〉募兌雀叩汀１容^不同克隆間的信號密度水平時(shí)克隆的純

55、度非常重要，也就是說必須保證所有篩選出來的空 斑必須100%陽性。5.5.2病毒空斑挑選和小量擴(kuò)增通過AdEasyTM系統(tǒng)純化得到的細(xì)菌克隆而產(chǎn)生的病毒空斑應(yīng)該幾乎都是（95%）重組病毒。每個(gè)細(xì)菌克隆最好測定至少12個(gè)空斑的表型。操作步驟1 .從培養(yǎng)板上挑選612個(gè)空斑，標(biāo)上圓圈。2 .無菌條件下用200 VL槍頭挑出克隆并轉(zhuǎn)入含 0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。3 . 37c病毒24小時(shí)。4 .鋪一塊每孔含1X105 QBI-293A細(xì)胞的24孔板。5 .移去培養(yǎng)液，輕輕加入 100 VL步驟3中清洗的病毒（約103病毒顆粒），切勿將細(xì)胞吹起，十字型輕輕晃動3次，轉(zhuǎn)入CO2孵箱37

56、c培養(yǎng)90分鐘。6 .加入DMEM5% ,使總體積為1mL,輕輕混勻。7 . 37 CO2孵箱培養(yǎng)直至完全出現(xiàn) CPE,在此MOI值下一力需要510天。如果10天后還沒出現(xiàn)CPE,說明此克隆的病 毒量太低，需要進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。8 .為從細(xì)胞中釋放病毒，在-20 C和37 c中充分凍融細(xì)胞 3次。9 .收集細(xì)胞，在15mL離心管中打碎。臺式離心機(jī)上以最大轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集上清并儲存于-80C。這一凍存液中大約有5X107VP/mL。如步驟7中所述，如果在第一次擴(kuò)增后CPE不完全，則進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于QBI-293A細(xì)胞含有腺病毒基因組的 E1區(qū)，因此E1區(qū)缺失的腺病毒與人染色體發(fā)生同源重組而產(chǎn)生有增殖能力的腺 病毒（RCA）的機(jī)率很低。發(fā)生這種回復(fù)突變的機(jī)率大約