蛋白質(zhì)的沉淀和變性試驗(yàn)

1、蛋白質(zhì)的沉淀與變性反應(yīng)目的(1) 了解蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關(guān)系。(2) 學(xué)習(xí)鹽析和透析等生物化學(xué)的操作技術(shù)。原理在水溶液中，蛋白質(zhì)分子的表面，由于形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒，所以蛋白質(zhì)溶液和其他親水膠體溶液相類(lèi)似。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。在一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。這種反應(yīng)可分為以下兩種類(lèi)型:一、可逆淀汲反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于原來(lái)的溶

2、劑中。這種作用稱(chēng)為可逆沉淀反應(yīng)，又叫作不變性沉淀反應(yīng)。屬于這一類(lèi)的反應(yīng)有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對(duì)蛋白質(zhì)的短時(shí)間作用以及利用等電點(diǎn)的沉淀等。二、不可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來(lái)的天然性質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來(lái)溶劑中的作用叫作不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽、植物堿試劑、過(guò)酸、過(guò)堿、加熱、震蕩、超聲波，有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。試劑和器材一、試劑1 蛋白質(zhì)溶液取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸儲(chǔ)水稀釋至100ml,攪拌均勻后用4-8層紗布過(guò)濾，新鮮配制。2 蛋白質(zhì)氯化鈉溶液取20ml蛋清，加蒸儲(chǔ)水200m

3、l和飽和氯化鈉溶液100ml,充分?jǐn)噭蚝?，以紗布濾去不溶物( 加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白) 。硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10%三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid) ， 0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸， 10%醋酸，飽和氯化鈉溶液，10%氫氧化鈉溶液。二、器材試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml燒杯， 10 ml 量筒。操作方法一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)的鹽析作用用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽析作用。蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下

4、，蛋白質(zhì)分子被鹽脫去水化層，同時(shí)蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭受破壞而沉淀析出。析出的蛋白質(zhì)仍保持其天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)。減低鹽的濃度時(shí)，還能溶解。沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度不同，而鹽類(lèi)不同也有差異。例如: 向含有白蛋白和球蛋白的雞蛋清溶液中加硫酸鎂或氯化鈉至飽和，則球蛋白沉淀析出。加硫酸錢(qián)至飽和，則白蛋白沉淀析出。另外，在等電點(diǎn)時(shí)，白蛋白可被飽和硫酸鎂或氯化鈉或半飽和的硫酸銨溶液沉淀析出。所以在不同條件下，用不同濃度的鹽類(lèi)可將各種蛋白質(zhì)從混合溶液中分別沉淀析出，該法稱(chēng)為蛋白質(zhì)的分級(jí)鹽析。目前在腌的生產(chǎn)和制備、科學(xué)研究工作和臨床化驗(yàn)等工作中廣泛應(yīng)用。取一支試管加入3m1

5、蛋白質(zhì)氯化鈉溶液和3m1飽和硫酸錢(qián)溶液，混勻，靜置約10 min,球蛋白則沉淀析出，過(guò)濾后向?yàn)V液中加入硫酸錢(qián)粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，達(dá)到飽和為止。析出的沉淀為白蛋白。靜置，倒去上部清液， 白蛋白沉淀，取出部分加水稀釋?zhuān)^察它是否溶解，留存部分作透析用。二、蛋白質(zhì)的不可逆沉激反應(yīng)1重金屬沉淀蛋白質(zhì)重金屬鹽類(lèi)易與蛋白質(zhì)結(jié)合成穩(wěn)定的沉淀而析出。蛋白質(zhì)在水溶液中是酸堿兩性電解質(zhì)， 在堿性溶液中（ 對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)而言） ， 蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的金屬離子結(jié)合成蛋白質(zhì)鹽。在有機(jī)體內(nèi)，蛋白質(zhì)常以其可溶性的鈉鹽或鉀鹽的形式存在，當(dāng)加入汞，鉛、銅、銀等重金屬鹽時(shí)，則蛋白質(zhì)形成不

6、溶性的鹽類(lèi)而沉淀。經(jīng)過(guò)這種處理后的蛋白質(zhì)沉淀不再溶解于水中，說(shuō)明它已發(fā)生了變性。 重金屬鹽類(lèi)沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)通常很完全，特別是在堿金屬鹽類(lèi)存在時(shí)。因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體液中的蛋白質(zhì); 臨床上用蛋白質(zhì)解除重金屬鹽的食物性中毒。但應(yīng)注意，使用醋酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，試劑不可加過(guò)量，否則可使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。取2支試管，各加入約1m1蛋白質(zhì)溶液，分別加入3 %硝酸銀3-4滴，0.5%醋酸鉛 1-3 滴和0.1%硫酸銅3-4 滴，觀察沉淀的生成。第一、二支試管再分別加入過(guò)量的醋酸鉛和飽和硫酸銅溶液，觀察沉淀的再溶解。2 .有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)有機(jī)酸能使蛋白質(zhì)沉淀。三氯醋酸和磺基水楊

7、酸最有效，能將血清等生物體液中 的蛋白質(zhì)完全除去，因此得到廣泛使用。取兩支試管，各加入蛋白質(zhì)溶液約 0.5 ml,然后分別滴加10%三氯醋酸和5%黃 基水楊酸溶液各數(shù)滴，觀察蛋白質(zhì)的沉淀。3 .無(wú)機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)濃無(wú)機(jī)酸（除磷酸外）都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)。這種沉淀作用可能是 蛋白質(zhì)顆粒脫水的結(jié)果。過(guò)量的無(wú)機(jī)酸（硝酸除外）可使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。 臨床診斷上，常利用硝酸沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)，檢查尿中蛋白質(zhì)的存在。取3支試管，分別加入濃鹽酸15滴，濃硫酸、濃硝酸10滴。小心地向3支試管 中，沿管壁加入蛋白質(zhì)溶液6滴，不要搖動(dòng)，觀察各管內(nèi)兩液界面處有白色環(huán)狀 蛋白質(zhì)沉淀出現(xiàn)。然后，搖動(dòng)每個(gè)試

8、管。蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)在過(guò)量的鹽酸及硫酸中溶 解。在含硝酸的試管中，雖經(jīng)振蕩，蛋白質(zhì)沉淀也不溶解。4 .加熱沉淀蛋白質(zhì)幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固， 變成不可逆的不溶狀態(tài)。鹽類(lèi)和氫離子 濃度對(duì)蛋白質(zhì)加熱凝固有重要影響。 少量鹽類(lèi)促進(jìn)蛋白質(zhì)的加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) 處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全、最迅速。在酸性或堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子帶 有正電荷或負(fù)電荷，雖加熱蛋白質(zhì)也不會(huì)凝固。若同時(shí)有足量的中性鹽存在，則 蛋白質(zhì)可因加熱而凝固。取5支試管。編號(hào)，按下表加入有關(guān)試劑（單位：滴）:試劑 管號(hào)蛋白質(zhì)溶液0.1%醋酸10%醋酸飽和NaCl10% NaOH蒸播水110-72105-2310-5-2410-52-510-25將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放人沸水浴中加熱 10 min,注意觀察比較 各管的沉淀情況。然后將第3, 4, 5號(hào)管分別用10%NaOH£ 10%醋酸中和，觀察并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將 3， 4， 5 號(hào)管繼續(xù)分別加入過(guò)量的酸或堿，觀察它們發(fā)生的現(xiàn)象。然后，用過(guò)量的酸或堿中和第3, 5號(hào)管，沸水浴加熱10 min,觀察沉淀變化，檢查這種沉 淀是否溶于過(guò)量的酸或堿中，并解釋實(shí)