課題6血紅蛋白的提取和分離知識點總結(jié)

1、課題6血紅蛋白的提取和分離知識點總結(jié)一、實驗原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千 差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1 .凝膠色譜法(分配色譜法)：(1)原理：分子量 大的分子通過 多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的 分子穿過 多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢 。(2)凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。(3)分離過程:混合物上柱一洗脫一大分子流動快、小分子流動慢一收集大分子一收集小分子*洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。(4)作用： 分離蛋白質(zhì)，測定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2 .緩沖溶液

2、(1)原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成(如H2CO3NaHCO3, NaH2PO4/Na2HPO4等)，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。(2) 緩沖液作用： 抵制外界酸、堿對溶液 pH 的干擾而保持 pH 穩(wěn)定。3 .凝膠電泳法：(1)原理：不同蛋白質(zhì)的 帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小 不同,在電場中受到的作用力 大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。(2)分離方法： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(3)分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的 SDS形成“蛋白質(zhì)-SDSM合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、

3、實驗步驟1 .樣品處理紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是 去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用 低速短時間 離心分離紅細(xì)胞， 然后用膠頭吸管吸出上層透明的 黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入五 倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min,低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在蒸儲水和甲苯作用下,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸儲水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜， 有利于血紅蛋白的釋放和分離。2 .粗分離分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4層。第一層為無色透明的 甲苯層，第2層為

4、白色薄層固體，是 脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是 血紅蛋白的水 溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 將試管中的液體用濾紙過濾， 除去之溶性沉淀層， 而夜漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入 透析袋中,將透析袋放入盛有 300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中 分子量較小 的雜質(zhì),或用于更 換樣品的緩沖液。3 .純化調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝J膠面平齊，關(guān)閉出口。加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動 加到色譜柱的頂端。加樣后，I打

5、開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，J關(guān)閉出口。調(diào)節(jié)緩沖液面：加入 20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集。4 .純度鑒定-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項1 .電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異， 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2 .紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、 未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高 和時間過長，會使白細(xì)胞

6、和淋巴細(xì)胞一同沉淀， 也得不到純凈的紅細(xì)胞， 影響后續(xù)血紅蛋白 的提取純度。3 .如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。4 .為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。5 .沸水浴處理加入洗脫液的

7、濕凝膠的目的不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物 和排除凝膠內(nèi)的空氣。6 . G-75“G代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7.裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。9與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點及這一特點對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義哺乳動物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。 其含有的血紅蛋白是有色蛋白， 因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀 ，大大 簡化 了實驗操作。10