熒光顯微技術(shù)在黎族藥物大青鑒定中的應(yīng)用

1、熒光顯微技術(shù)在黎族藥物大青鑒定中的應(yīng)用 作者：田建平，胡遠(yuǎn)艷，張俊清【摘要】 目的：探討利用熒光顯微技術(shù)對(duì)黎族藥物大青進(jìn)行顯微鑒別的可行性，并為建立大青藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。方法：利用研究級(jí)正置熒光顯微鏡對(duì)未經(jīng)試劑處理的大青莖粉末和新鮮葉片進(jìn)行觀察，并拍照。結(jié)果：大青莖粉末中主要含有3種類型的纖維，還含有木栓細(xì)胞、網(wǎng)狀導(dǎo)管、方晶、腺毛和非腺毛、鐘乳體，且圖像清晰。更特別的是在表皮細(xì)胞中還含有銅錢狀的物質(zhì)及一圈熒光存在于皮層中。在葉片下表皮中氣孔數(shù)較多，角質(zhì)層細(xì)胞波紋狀、還有鐘乳體、2細(xì)胞的腺毛、非腺毛等結(jié)構(gòu)。結(jié)論：利用熒光顯微鏡鑒別生藥粉末，操作簡(jiǎn)便，圖像直觀，值得開發(fā)利用。在葉片鑒別方面

2、角質(zhì)層、腺毛等結(jié)構(gòu)清晰可辯，可代替掃描電子顯微鏡，但是還需結(jié)合普通光學(xué)顯微鏡來確定氣孔的類型。 【關(guān)鍵詞】 熒光顯微鏡；大青；黎族藥物；顯微鑒定ABSTRACT Objective: To explore the feasibility of fluorescence microscopic technique in the identification of Clerodendrum cyrtophyllum used in Li medicine and to collect scientific evidence for the development of its quality st

3、andards. Methods： The stem powder without reagent and fresh leaves of Clerodendrum cyrtophyllum were observed and photographed under fluorescent microscopy. Results：Under fluorescent microscopy, it was clearly shown that stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum was mainly consisted of 3 types of fib

4、er, cork cells, mesh tube, square crystal, glandular, non glandular and cystolith. More specifically, there were coinlike substances in the epidermis, a fluorescent ring in the cortex. Many stomata in the lower epidermis with ripplelike cuticle cells, cystolith, 2 cells glandular hairs, nonglandular

5、 hairs were shown in the fresh leaves images. Conclusions：It is feasible to use fluorescence microscopic technique in the identification of stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum and the cuticle cells and glandular hairs in fresh leaves, but light microscope is also needed for the identification o

6、f stomata types. KEY WORDS Fluorescence microscopy; Clerodendrum cyrtophyllum; Li medicine; Microscopic identification黎族藥物大青來源于馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., 其根、莖、葉入藥，夏秋季采收，洗凈，鮮用。長(zhǎng)期以來在華南地區(qū)常代替板藍(lán)根使用1-3。其黎藥名為雅楓能，莖葉入藥，具有清熱解毒的功效4。前人已對(duì)其根、莖的橫切片顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，但是對(duì)莖粉末結(jié)構(gòu)的研究未見報(bào)道，在葉結(jié)構(gòu)方面,也未見有研究報(bào)道5。另外，以往研究均利

7、用普通光學(xué)顯微鏡，均需用試劑處理，才能觀察，并需一定的繪圖機(jī)能。在熒光技術(shù)方面，以往的熒光分析技術(shù)需將有效成分用試劑提取后才能在熒光分光光度計(jì)下測(cè)量其熒光光譜6,7，操作較麻煩。在葉片研究方面有報(bào)道認(rèn)為利用熒光顯微鏡可觀察氣孔形狀，但不知對(duì)葉片其他結(jié)構(gòu)形態(tài)是否有效8，因此，在本研究中通過嘗試對(duì)未經(jīng)試劑處理的生藥粉末和新鮮葉片在熒光顯微鏡下，進(jìn)行觀察，以探討利用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行生藥顯微鑒定的可行性,為開拓一種簡(jiǎn)便有效的顯微鑒定方法，同時(shí)為黎族藥物大青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及開發(fā)黎藥提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與儀器 馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turc

8、z., 從海南醫(yī)學(xué)院黎族藥用植物觀賞園采集，將其莖去掉葉片后曬干粉碎，取其粉末作為試驗(yàn)材料。另外在實(shí)驗(yàn)前夕取成熟大青葉片一塊，沖洗干凈晾干備用。所用儀器為研究級(jí)正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）。1.2 方法 在研究級(jí)正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）的自然光下找到大青莖粉末觀察目標(biāo)，再關(guān)上光柵，在熒光下觀察，并拍照。從備用大青葉片中間剪取2mm×2mm的葉塊，背面朝上置于載玻片蓋上蓋玻片后,同樣先在自然光下找到觀察目標(biāo)，再關(guān)上光柵，在熒光下觀察，并拍照。2 結(jié)果2.1 大青莖粉末觀察結(jié)果 粉末淡黃色，含有的纖維主要有3種，即X形，L形和分叉狀等纖維（圖1AC），木栓

9、細(xì)胞表面觀四邊形，排列較整齊（圖1D），晶鞘纖維含量豐富，里面同樣含有很多數(shù)量的方晶（圖1E）。導(dǎo)管多破碎，多為網(wǎng)紋導(dǎo)管（圖1FG），在粉末中含有鐘乳體、石細(xì)胞（圖1HI）,在木部薄壁細(xì)胞可看到一圈綠色的熒光，很快消失。在粉末中含有一定數(shù)量的非腺毛和腺毛（圖1JK），值得注意的是在表皮細(xì)胞中還有許多銅錢狀的分泌組織（圖1L）。2.2 大青新鮮葉觀察結(jié)果 大青葉下表皮淺綠色，在熒光顯微鏡下其角質(zhì)層細(xì)胞垂周壁波狀或深波狀彎曲（圖1M），在葉表皮中可以看到存在鐘乳體（圖1N），單位面積上氣孔數(shù)量較多，同時(shí)也存在較多2細(xì)胞的腺毛，及少量非腺毛（圖1O）。 3 討論3.1 大青莖粉末結(jié)構(gòu)與大青莖橫切片結(jié)

10、構(gòu)比較 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道3, 大青莖（徑約5mm）之橫切面，最外緣表皮細(xì)胞，散見非腺毛；皮層韌皮纖維與石細(xì)胞，多個(gè)連生，排列成環(huán)，強(qiáng)木化，形成層，23層，細(xì)胞小，呈類長(zhǎng)方形或扁長(zhǎng)方形。木質(zhì)部，由導(dǎo)管、木部薄壁細(xì)胞、髓線所組成，導(dǎo)管單個(gè)或24個(gè)連生，主要為網(wǎng)紋導(dǎo)管；髓線細(xì)胞呈類長(zhǎng)方形、類方形及扁長(zhǎng)方形；木部薄壁細(xì)胞，與導(dǎo)管伴生，細(xì)胞呈類長(zhǎng)方形、類方形及扁長(zhǎng)方形。中央為髓部，散見石細(xì)胞及草酸鈣方晶。 本組研究中，大青粉末除含有上述非腺毛、石細(xì)胞、方晶、導(dǎo)管、纖維外還具有少數(shù)腺毛和鐘乳體，而鐘乳體是馬鞭草科植物的一個(gè)顯著特征。另外纖維的種類也較豐富，因此粉末研究是生藥顯微研究中不可缺少的內(nèi)容。由于大青在華

11、南地區(qū)分布比較廣泛，但不同地區(qū)其有效成分的含量有所不同，其有效成分的含量高低直接影響其治療效果，而在熒光顯微鏡下可在木部薄壁細(xì)胞觀察到一圈顯著的綠色熒光，這可能是大青莖有效成分的存在部位，根據(jù)其熒光強(qiáng)度的不同可比較來源于不同地區(qū)的大青莖質(zhì)量的優(yōu)劣。3.2 不同顯微鏡觀察大青莖粉末結(jié)構(gòu)效果的比較 以往對(duì)生藥粉末形態(tài)觀察一般先采用水合氯醛透化，稀甘油裝片后再在普通光學(xué)顯微鏡觀察，由于受稀甘油等試劑的影響，觀察效果不是較理想，且觀察的結(jié)構(gòu)形態(tài)一般平面狀態(tài)；但是在熒光顯微鏡下操作步驟簡(jiǎn)便，生藥不須試劑處理，可直接用粉末裝片觀察，由于無甘油等試劑干擾影響，其視野潔靜，結(jié)構(gòu)層次感較強(qiáng)。如所觀察的晶纖維、木

12、栓細(xì)胞等，因此，整體效果要優(yōu)于普通光學(xué)顯微鏡。更重要的是，在熒光顯微鏡下，有些結(jié)構(gòu)可發(fā)出熒光，如大青莖粉末含有的不同纖維發(fā)出的熒光及亮度不一樣，為我們鑒別不同種類的生藥提供了重要的依據(jù)。3.3 不同顯微鏡觀察大青新鮮葉結(jié)構(gòu)效果的比較 在熒光顯微鏡下觀察新鮮大青葉片的下表皮，能夠清晰地觀察到氣孔的數(shù)量及腺毛、非腺毛，其次在葉片上觀察到其存在著一定數(shù)量的鐘乳體，立體狀的波紋狀角質(zhì)層細(xì)胞也很容易觀察，另外可清晰地看到氣孔的開合狀態(tài)，在一定程度上利用熒光顯微鏡可代替掃描電子顯微鏡觀察上述葉片結(jié)構(gòu)。關(guān)于氣孔類型，已有的關(guān)于馬鞭草科氣孔的觀察研究通過解離染色方法證明該科中氣孔類型較為豐富，有直軸式、平周式

13、、不定式等5，但在熒光顯微鏡下葉片氣孔的類型不好判別，因此其有一定缺陷，而據(jù)我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下將大青葉下表皮撕裂后加蒸餾水后觀察，大青葉氣孔類型很容易就能被判斷為無規(guī)則形，因此判別葉片氣孔的類型還需利用將下表皮撕裂或解離后等方法再在普通光學(xué)顯微鏡觀察才方便。 近年來，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，迅速地推動(dòng)了中藥或生藥鑒定的發(fā)展9,10，關(guān)于生藥顯微鑒別儀器，常見的有普通光學(xué)顯微鏡、偏振光顯微鏡、掃描電子顯微鏡等，利用熒光顯微鏡進(jìn)行化學(xué)成分組織定位也有報(bào)道11，但最常見的儀器是光學(xué)顯微鏡，在鑒別生藥方面熒光顯微鏡的使用還未見報(bào)道。我們利用熒光顯微鏡觀察黎族藥物大青莖粉末和新鮮葉片顯微構(gòu)造是一次成功的嘗

14、試，它為生藥顯微鑒定開拓了一條新的途徑，且操作簡(jiǎn)便，無須任何試劑處理，保留了生藥的原樣，圖像更加直觀、清晰，值得深入研究。但也需要注意，有些部位熒光消失較快，需快速觀察。本組資料只探討了定性實(shí)驗(yàn)問題，其他涉及到如何對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行定量等問題還需繼續(xù)探討，但是至少我們知道化學(xué)成分存在的部位，這為我們繼續(xù)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)提供了契機(jī)。由于本次研究材料中無淀粉粒結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)在熒光顯微鏡下效果如何？有待下次在其他材料中研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 李艷，趙慶春，郭濤，等.大青根化學(xué)成分的研究J.中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2008,18(5):371373.2 趙慶春,李艷,蔡海敏,等.大青根化學(xué)成分的研究()J.中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2009，19(4):280283.3 何玉鈴 ,郭昭麟, 高國(guó)清,等.板藍(lán)根藥材之鑒別研究J.中醫(yī)藥雜志, 2001, 12(4): 267283.4 劉明生. 黎藥學(xué)概論M.北京: 人民衛(wèi)生出版社,2008.5 朱栗瓊，招禮軍，陶世紅，等. 馬鞭草科9種植物葉表皮特征及其分類學(xué)意義J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007，35(23):70577058.6 李云，劉毅，喬賽男，等. 紫花前胡的熒光光譜J. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版),2006,30:271273.7 劉煒，周建理，周蜀娟，等.常用中藥材的熒光觀察J.安徽醫(yī)藥，2006，10（5）：3