CRISPRCas9精細原理基因敲除點突變基因插入解讀

1、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9大全：大全：基因敲除、點突變、基因插入基因敲除、點突變、基因插入2015-10-15pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)簡介系統(tǒng)簡介pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應用技術系統(tǒng)的應用技術pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應用前景系統(tǒng)的應用前景1. CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介系統(tǒng)簡介1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史系統(tǒng)的研究歷史p 1987 年，日本課題組在年，日本課題組在K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的

2、基因組中，隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，2002 年，年，正式將其命名為正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列重復序列p 2005 年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源，推測細菌可能通過高度同源，推測細菌可能通過CRISPR 系統(tǒng)可能以類似于真核生物的系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質的入侵。方式抵抗外源遺傳物質的入侵。p 2007 年，年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用CRSPR 系統(tǒng)抵抗噬菌體

3、入系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細菌等發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源質粒的轉系統(tǒng)能阻止外源質粒的轉移，首次利用實驗驗證了移，首次利用實驗驗證了CRISPR 系統(tǒng)的功能系統(tǒng)的功能p 2013 年初，年初，MIT 的研究組首次利用的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對人系統(tǒng)對人293T 細胞細胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 細胞細胞Th 基因實現(xiàn)了定點突變。同基因實現(xiàn)了定點突變。同年年Mali 利用利用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 細胞和細胞和K652 細胞基因的靶位點形成細胞基因的靶位點形成雙鏈

4、或單鏈的切口，從而激活細胞的雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA 修復機制高效介導外源基因定修復機制高效介導外源基因定點插入。點插入。 1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的結構系統(tǒng)的結構pCRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括: 由不連續(xù)的重復序列R( repeat) 與長度相似的間區(qū)序列S( spacers) 間隔排列而成的CRISPR 簇，前導序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相關蛋白基因cas。 CasCas蛋白是一種雙鏈蛋白是一種雙鏈DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引導下對靶位點進行切割。它引導下對靶位點進行切割。它與與folkf

5、olk酶功能類似，但是它并不需要形酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。成二聚體才能發(fā)揮作用。1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理系統(tǒng)的作用機理p CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得 首先識別入侵的核酸和掃描外源 DNA 潛在的 PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重復序列；最后新的間隔序列整合到兩個重復序列之間1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理系統(tǒng)的作用機理p CRIPSR 基因座的表達(包括轉錄和轉錄后的成熟加工) 當該

6、噬菌體再次入侵細菌時，CRISPR 簇首先轉錄為長的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對外源遺傳物質的干擾 crRNA 結合相關的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復合體，通過堿基互補配對精確地與目標DNA相結合，隨后Cas 蛋白對目標DNA 進行斷裂和降解。1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理系統(tǒng)的作用機理2 2、CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應用系統(tǒng)的應用2.1 CRISPR-Cas9介導的基因組精確編輯介導的基因組精確編輯技術技術p 基因組編輯技術是一種可以在基

7、因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。p 這種技術的原理是構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產生突變，從而達到定點改造基因組的目的。p 通過修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因p 基因組編輯是研究基因功能的重要手基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術成為現(xiàn)代分子的治療，因此這類技術成為現(xiàn)代分子生物學的研究熱點生物學的研究熱點2.1 2.1 CRISPR-CasCRISPR-Cas9 9介導的基因

8、組精確編輯技術介導的基因組精確編輯技術 CRISPRs技術是一種由RNA指導Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術。 Mali 等人 利用來自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR 相關蛋白Cas9，在一段人為重組的sgRNA( small-guide RNA) 的引導下，針對小鼠和人類基因組的特定基因片段實現(xiàn)了精確的剪切。這種通過可編程RNA 進行DNA 改造的技術為基因組編輯開創(chuàng)了一條新的途徑。例子：基因敲除的實驗過程1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設計出sgRNA并合成該序列。2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。3、轉化感受

9、態(tài)，質粒小提，測序驗證。4、細胞培養(yǎng)與細胞轉染5、敲除效果檢測。6、建立穩(wěn)定敲除的細胞株2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活介導的轉錄抑制與轉錄激活p 在在CRISPR/Cas9的的型系統(tǒng)中將型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會使中的切割域突變，會使Cas9蛋白蛋白失去對的切割活性，但不影響其與失去對的切割活性，但不影響其與 結合的能力結合的能力。這種失。這種失去切割活性的去切割活性的Cas9蛋白被命名為蛋白被命名為Dead as9。將。將Cas9與與gRNA在細胞中共表達，則在細胞中共表達，則gRNA可以介導可以介導Cas9蛋白與蛋白與 結合。結合

10、。如果如果Cas9結合到靶基因的閱讀框內，可阻斷結合到靶基因的閱讀框內，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；聚合酶的延伸作用；如果如果Cas9結合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉錄的起始結合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉錄的起始2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活介導的轉錄抑制與轉錄激活p CRISPRCas9系統(tǒng)用于轉錄抑制需要PAM（bp）和至少12bp的gRNA配對p 利用cr介導dCas9能夠精確識別靶基因的特點，將Cas蛋白與具有轉錄激活的蛋白質功能域融合則可構建具有轉錄激活活性的CRISPRon系統(tǒng)。p 真核細胞的轉錄激活因子可通過將Ca

11、s9與單純皰疹病毒轉錄激活子16結合獲得。3 3、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技術的優(yōu)勢與前景技術的優(yōu)勢與前景3.1CRISPR-Cas93.1CRISPR-Cas9技術的優(yōu)勢技術的優(yōu)勢p而且從實際應用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就行。p只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。p編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構TALENs和ZFNs更簡單方便。p較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。3.2 CRISPR-Cas93.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用前景系統(tǒng)的應用前景p目前應用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究主要集中在基因編輯方面。而Cas9真正的優(yōu)勢主要在于它具有能夠將種主要生物聚合物（、和蛋白質）結合在一起的特殊能力。p各種功能性蛋白都可以通