2019實(shí)驗(yàn)一二重組質(zhì)粒DNA提取、雙酶切鑒定、凝膠電泳、紫外分光法ppt課件

1、朱文博朱文博中山醫(yī)學(xué)院中山醫(yī)學(xué)院v基因克隆示意圖基因克隆示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽(yáng)性克隆株繁殖表達(dá)分、切分、切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩基因工程基因工程v定義：定義：v 實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)，又稱重技術(shù)，又稱重組組DNA技術(shù)。技術(shù)。 基因載體基因載體基因工程中常用的載體基因工程中常用的載體(vector)(vector)主要包括主要包括質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)(plasmid)、噬菌體、噬菌體(phage)(phage)和病毒和病毒(virus)(virus)柯斯質(zhì)粒。這些

2、載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致柯斯質(zhì)粒。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用作用 ; ;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶酶掌握掌握DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的原理和步驟；的瓊脂糖凝膠電泳的原理和步驟；掌握紫外分光光度計(jì)對(duì)掌握紫外分光光度計(jì)對(duì)DNADNA含量的測(cè)定方法。含量的測(cè)定方法。一一.質(zhì)粒質(zhì)

3、粒DNA的提取的提取1 1 關(guān)于質(zhì)粒的概念關(guān)于質(zhì)粒的概念a.a.什么是質(zhì)粒什么是質(zhì)粒plasmidplasmid）？）？b.b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.d.質(zhì)粒的用途有哪些？質(zhì)粒的用途有哪些？71.1 1.1 質(zhì)粒的定義質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈狀雙鏈DNADNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。染色體上。 在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺在細(xì)

4、胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。旋形式存在。 8(1) (1) 超螺旋超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)DNA (supercoiled DNA, SC DNA)1.2 1.2 質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型9(2) (2) 開環(huán)開環(huán)DNA (open circular DNA, OC DNA)DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。環(huán)狀分子。10(3) 線狀線狀DNA

5、 (linear DNA, L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？）電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？） 11最快中最慢1.3 1.3 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的一般特性：的一般特性：(1) (1) 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子, ,有相對(duì)有相對(duì)獨(dú)立性。獨(dú)立性。(2) (2) 它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型：菌毛、抗藥性等一些表型：菌毛、抗藥性等(3) (3) 它是雙鏈閉合環(huán)狀它是雙鏈閉合環(huán)狀DNADNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。(4) (4) 質(zhì)

6、粒質(zhì)粒DNADNA與宿主菌染色體與宿主菌染色體DNADNA的兩點(diǎn)不同：的兩點(diǎn)不同： 宿主菌染色體宿主菌染色體DNADNA通常比質(zhì)粒通常比質(zhì)粒DNADNA要大要大得多得多 純化分離的宿主菌純化分離的宿主菌DNADNA多為線性分子，多為線性分子，而質(zhì)粒而質(zhì)粒 DNA DNA呈閉合環(huán)的形式。呈閉合環(huán)的形式。 131.4 1.4 提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA的目的與意義：的目的與意義： 基因載體基因載體/ /基因克隆基因克隆/ /基因工程基因工程2.1 2.1 提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA的常規(guī)方法的常規(guī)方法 (1)SDS (1)SDS堿裂解法堿裂解法 (2) (2)煮沸法煮沸法 (3) high p

7、ure plasmid isolation kit (3) high pure plasmid isolation kit等。等。 但原理相似，都是利用宿主染色體但原理相似，都是利用宿主染色體DNADNA和和質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的差異來(lái)分離的。的差異來(lái)分離的。2 2 提取大腸桿菌質(zhì)粒提取大腸桿菌質(zhì)粒DNADNA的的方法和原則方法和原則2.2 2.2 分離純化質(zhì)粒分離純化質(zhì)粒DNADNA的主要步驟的主要步驟(1)(1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增DNADNA的擴(kuò)增與選擇）的擴(kuò)增與選擇）(2)(2)細(xì)菌的收集與裂解細(xì)菌的收集與裂解 收集方法：高速離心的方法收集方法：高速離心的方法裂解細(xì)菌方

8、法：去污劑法、有機(jī)溶劑法、裂解細(xì)菌方法：去污劑法、有機(jī)溶劑法、 堿變性法、沸水堿變性法、沸水 熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。 根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 純化方法等因素綜合后加以選擇。純化方法等因素綜合后加以選擇。 (3)(3)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化的純化 常用的方法有：超速離心、層析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速離心、層析法、聚乙二醇沉淀法等 所有純化方法都是利用了質(zhì)粒所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNADNA相對(duì)較相對(duì)較 小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。 2.3 2.3 核酸分離純化的總

9、原則：核酸分離純化的總原則： (1) 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整 (2) 排除其他分子的污染蛋白質(zhì)、脂類、排除其他分子的污染蛋白質(zhì)、脂類、 糖、糖、 有機(jī)溶劑、金屬離子、其他有機(jī)溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）等）3. SDS-3. SDS-堿裂解法提取堿裂解法提取Puc119-U6Puc119-U6重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNADNA3.1 3.1 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：高堿高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放染色體染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA；線性雙鏈線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。片段中的氫鍵斷裂，雙鏈

10、解離變性。質(zhì)粒質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；雙鏈雙鏈DNA并不完全分離。并不完全分離。高酸高酸中和中和至中至中性性變性的染色體變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化純化RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)3.2 3.2 主要試劑及作用主要試劑及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisHClHCl組成組成

11、.(.(維護(hù)、緩沖維護(hù)、緩沖) ) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度葡萄糖的作用是增加溶液的粘度, ,減少抽提過(guò)程中的減少抽提過(guò)程中的 機(jī)機(jī)械械 剪切作用剪切作用, ,防止破壞質(zhì)粒防止破壞質(zhì)粒. (. (保護(hù)作用保護(hù)作用) ) EDTA EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子, , 防止防止DNADNA酶對(duì)酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用） Tris TrisHCl HCl 能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PHPH范圍緩沖作范圍緩沖作用）用）19 溶液溶液II：由：由SDS十二烷基硫酸鈉與十二烷基硫酸鈉與 N

12、aOH 組成組成(裂解、變性裂解、變性) SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之 變性裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）變性裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用） NaOHPH12的作用是破壞氫鍵，使的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性DNA變性作用）變性作用） 20溶液溶液IIIIII：HAC(HAC(乙酸乙酸) )和和 KAC( KAC(乙酸鉀乙酸鉀) )組成的高鹽溶液組成的高鹽溶液 ( (復(fù)性，分別復(fù)性，分別) )HACHAC溶液能中和溶液溶液能中和溶液的堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA

13、DNA復(fù)性。復(fù)性。KACKAC會(huì)與會(huì)與SDSSDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也會(huì)與蛋白質(zhì)也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS-SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNADNA分離。分離。 3.3 3.3 實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步步驟驟加加1.5ml1.5ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EPEP管，管，12000g12000g30S30S除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 l 200 l 溶液溶液I I，劇烈振蕩，劇烈振蕩EPEP管，室溫管，室溫3min3min加入加入200l 200l 溶液溶液I

14、III，快速顛倒數(shù)次，冰浴，快速顛倒數(shù)次，冰浴3min3min加入加入150l 150l 冰溶液冰溶液IIIIII，溫和振蕩，溫和振蕩10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000g12000g5min5min轉(zhuǎn)移上清到新轉(zhuǎn)移上清到新EPEP管，加入等體積酚管，加入等體積酚/ /氯仿氯仿(1:1)(1:1)，溫和振蕩，冰浴，溫和振蕩，冰浴3min3min，12000g12000g5min5min上層水相轉(zhuǎn)移到新上層水相轉(zhuǎn)移到新EPEP管，加入管，加入2 2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20 -20 冰箱中放置冰箱中放置15min15min，12000g12000g

15、10min 10min 棄上清，沉淀中加棄上清，沉淀中加1ml 70%1ml 70%乙醇，乙醇，12000g12000g5min 5min 去上清，管平放室溫靜置去上清，管平放室溫靜置10min10min， 20 l TE 20 l TE 溶解溶解DNADNARCF =1.12rrpm/1000)2RCF: 離心力離心力g）r: 離心半徑離心半徑mm）rpm: 每分鐘轉(zhuǎn)速每分鐘轉(zhuǎn)速r/min）本卷須知：本卷須知： 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用； 2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型；、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加

16、不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 6、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀；、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀； 7、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到要沾到 皮膚；皮膚； 8、 每人最終得到每人最終得到20ul質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，其中，其中10ul用于酶用于酶 切和電泳，其余切和電泳，其余10ul用于下次的轉(zhuǎn)化實(shí)用于下次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，切驗(yàn)，切 記！記！二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 1 1 關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶 （restriction endonucleaserestriction e

17、ndonuclease）1.1 1.1 定義定義 能在特異位點(diǎn)酶切位點(diǎn)上催化能在特異位點(diǎn)酶切位點(diǎn)上催化雙鏈雙鏈DNADNA分子的斷裂分子的斷裂, ,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNADNA片段。片段。 主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。 切割不同來(lái)源的切割不同來(lái)源的DNADNA分子將產(chǎn)生特征分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”）。）。251.3 1.3 作用作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源制修飾系統(tǒng)，限制外源DNADNA， 保護(hù)保護(hù)自身自身DNADNA。1.2 1.2

18、 分類分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。1.4 1.4 命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶2 BamHI 2 BamHI 、HindHind酶切質(zhì)粒及鑒定酶切質(zhì)粒及鑒定2.1 2.1 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 利用

19、限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNADNA特異的特異的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNADNA片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因重組質(zhì)粒別目的基因重組質(zhì)粒DNADNA）28重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒BamHIHind III雙酶切雙酶切電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind IIIPUC1193.2Kb）U6啟動(dòng)子256bp）2.2 2.2 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料: :

20、(1) (1)重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒; ; (2)BamHI (2)BamHI 、Hind Hind 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶; ; (3) (3)反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)緩沖液。312.3 2.3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟(1)(1)建立反應(yīng)體系建立反應(yīng)體系(2)(2)酶切反應(yīng)溫育酶切反應(yīng)溫育1-2h1-2h）(3)(3)電泳鑒定電泳鑒定322.4 2.4 雙酶切體系雙酶切體系 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA DNA 10l10l 10 10M M buffer 2lbuffer 2l BamH BamH 1l1l Hind Hind 1l1l ddH2O ddH2O 6l6l 33合計(jì)合計(jì) 20l 準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室老師已老師已加好

21、加好同學(xué)自己加同學(xué)自己加37 ，1-2h思考題？v為什么要對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切？341 1 原理原理 在在pH8.0pH8.0堿性的環(huán)境中堿性的環(huán)境中DNADNA的的磷酸基團(tuán)解離，使磷酸基團(tuán)解離，使DNADNA在該環(huán)境中帶負(fù)在該環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因?yàn)楦鞣N為各種DNADNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，它們?cè)谕ㄟ^(guò)凝膠立體網(wǎng)格時(shí)象不同，它們?cè)谕ㄟ^(guò)凝膠立體網(wǎng)格時(shí)所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。 DNA DNA顯色劑多用顯

22、色劑多用EBEB，它能和堿基間，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在紫外光照射下呈橘紅的氫鍵結(jié)合，在紫外光照射下呈橘紅色色530nm530nm的熒光。的熒光。35三、酶切質(zhì)粒三、酶切質(zhì)粒DNA后的瓊脂糖凝膠后的瓊脂糖凝膠電泳電泳1.1 1.1 影響影響DNADNA在凝膠中遷移速率的因素在凝膠中遷移速率的因素 v1 DNA分子的大小v2 構(gòu)象v3 凝膠濃度v4 電壓v5 緩沖液1.2 1.2 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（，瓊脂糖濃度（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍分子的有效分離范圍kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2

23、-32.0 0.1-22 2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料及試劑 瓊脂糖瓊脂糖 電泳緩沖液：電泳緩沖液：1 1TAETAE 10 10 加樣緩沖液加樣緩沖液 EB EB染色液染色液 它能和堿基間它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長(zhǎng)為的氫鍵結(jié)合，在波長(zhǎng)為254nm365nm254nm365nm的紫外光照射下呈橘紅色的紫外光照射下呈橘紅色530nm530nm的熒光的熒光. . 瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備（封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）拔梳）倒緩沖液，加樣倒緩沖液，加樣（取酶切質(zhì)粒（取酶切質(zhì)粒DNA樣品液樣品液 20l + 4l上樣緩沖液，混勻上樣緩沖

24、液，混勻 ）電泳電泳100V 0.5小時(shí)，小時(shí)，5V/cm）染色與檢測(cè)染色與檢測(cè)（EB染色染色5 min，洗脫，洗脫3min，紫外，紫外燈下檢測(cè)）燈下檢測(cè)）3 3 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟一、電泳前準(zhǔn)備準(zhǔn)備內(nèi)容作用1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水洗凈晾干防止不必要的重復(fù)污染，減少外來(lái)的污染。梳子干凈有利于梳孔的形成。2.檢查電泳槽，根據(jù)情況更換buffer排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer的緩沖能力，減少污染。3.根據(jù)DNA的分離范圍選擇合適的膠濃度并記錄達(dá)到較好的分離效果，防止樣過(guò)快跑出膠或者是過(guò)慢浪費(fèi)時(shí)間。4.計(jì)算agarose的用量和制膠 buffer的用量記錄，膠最終越薄越

25、好。實(shí)驗(yàn)記錄備查二、制膠步驟注意事項(xiàng)1.稱量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，稱量相對(duì)準(zhǔn)確2.融膠，加熱到膠產(chǎn)生大量的氣泡時(shí)，拿出搖勻，繼續(xù)加熱到完全溶解，拿出搖勻，再加熱到沸騰。非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過(guò)度使膠沖出瓶子。因此注意選擇起碼為膠體積2倍以上的瓶子。保證膠混勻和完全溶解，減少可能因此引起的膠中孔徑不均勻影響分離效果。3.倒膠，可用水浴的辦法使膠冷卻到60度左右，即手可以握住瓶子的溫度，沿著制膠板的一側(cè)，緩緩地一次性倒入。梳子最好是預(yù)先放好并固定的，注意梳孔的體積能點(diǎn)的下所有的樣。用槍頭趕掉氣泡。制膠的桌面相對(duì)水平。倒膠時(shí)盡量減少氣泡的產(chǎn)生。EB如果在

26、制膠時(shí)加入，在60度左右時(shí)加入，使終濃度為0.5ug/ml。不宜過(guò)低，染色成像不明顯；不宜過(guò)高，導(dǎo)致背景太深。搖勻要沿著瓶壁搖動(dòng)，盡量減少氣泡產(chǎn)生的可能性。高濃度膠例如2%以上的EB很難搖勻，而且凝的速度也相對(duì)快，強(qiáng)烈建議跑完膠之后再用EB染色。4.室溫凝膠30分鐘過(guò)程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動(dòng)。時(shí)間不宜過(guò)久，導(dǎo)致膠干燥變形；不宜過(guò)短，影響膠內(nèi)部孔徑形成。5.拔梳子，放入電泳槽。緩緩地將梳子垂直從梳孔拔出，盡可能使梳子是同時(shí)從各個(gè)膠孔拔出的。暫時(shí)不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。電泳液要浸沒(méi)膠1mm。三、上樣電泳步驟注意事項(xiàng)1.樣品中加入loading buffer使其終濃度為1

27、 X，混勻Loading buffer濃度不宜過(guò)低，點(diǎn)樣時(shí)樣品不能很好的沉在膠孔里；不宜過(guò)高，電泳時(shí)容易形成帶形的變形。注意混勻。2.點(diǎn)樣沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過(guò)多的氣泡，拔起時(shí)不要過(guò)猛帶出樣品。每點(diǎn)一個(gè)樣完，吸取buffer洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強(qiáng)烈建議每點(diǎn)一個(gè)樣換一次槍頭。加樣的速度當(dāng)然是越快越好，注意保證質(zhì)量。點(diǎn)樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面兩不要太大，容易導(dǎo)致脫尾和模糊不清。3.接通電源，選擇合適的電壓和時(shí)間電泳。膠孔與電極成水平狀態(tài)，防止樣品跑歪。跑膠期間不時(shí)回來(lái)看看，防止樣品跑出膠等意外發(fā)生。

28、四、染色成像步驟注意事項(xiàng)1.染色如果膠中沒(méi)有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分鐘。2.調(diào)整鏡頭的拍攝范圍和焦距，成像3.打印照片做分析記錄思考題？v酶切前后的對(duì)比？44M酶切后酶切前點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣孔細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNAOC 型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNAL型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNASC 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA細(xì)菌細(xì)菌RNA質(zhì)質(zhì)粒粒電電泳泳圖圖譜譜四、紫外分光光度法檢測(cè)四、紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度濃度1 1 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)1.1 1.1 概述概述 分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析的的吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)技術(shù)。471.

29、2 1.2 特點(diǎn)特點(diǎn) 靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10105 510106mol/L6mol/L準(zhǔn)確度高：能夠滿足微量組分的測(cè)定要求，準(zhǔn)確度高：能夠滿足微量組分的測(cè)定要求，相對(duì)誤差相對(duì)誤差2 25 5（1 12 2）; ;操作簡(jiǎn)便快速操作簡(jiǎn)便快速; ;應(yīng)用廣泛。應(yīng)用廣泛。482.1 2.1 分光光度計(jì)的基本部件分光光度計(jì)的基本部件光光 電電492 2 紫外分光光度法的原理紫外分光光度法的原理（氫燈、氘燈）（氫燈、氘燈）入射光反射光分散光吸收光透過(guò)光入射光反射光分散光吸收光透過(guò)光用溶劑作為用溶劑作為“空白校正反射光、分散光空白校正反射光、分散光入射光入射光I0I0）吸收光透過(guò)光）吸收光透過(guò)光ItIt）50光吸收基本定律光吸收基本定律: Lambert-Beer: Lambert-Beer定律定律 D DK C LK C L 吸光度吸光度 摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù) 吸收物質(zhì)的光徑吸收物質(zhì)的光徑cmcm） 溶液濃度溶液濃度mol/Lmol/L）2.2 2.2 分光光度法分析的依據(jù)：分光光度法分析的依據(jù)：物質(zhì)對(duì)光是有選擇的吸收，其吸收光譜取物質(zhì)對(duì)光是有選擇的吸收，其吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這就是分光光度法定性決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這就是分光光度法定性分析的依據(jù)；分析的依據(jù)；其吸收光譜的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度有關(guān)，這其吸收