第十章發(fā)酵工程各論-氨基酸發(fā)酵工藝

1、第十章第十章 氨基酸發(fā)酵工藝氨基酸發(fā)酵工藝10.1 概述10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝10.1 概述氨基酸的應(yīng)用 1、食品工業(yè)：營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑；鮮味劑；甜味劑。 2、飼料工業(yè)：營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。 3、醫(yī)藥工業(yè)：氨基酸輸液；氨基酸衍生物；氨基酸鹽。 4、化學(xué)工業(yè)：洗滌劑；護(hù)膚品；人造革。 5、農(nóng)業(yè)：無(wú)公害農(nóng)藥。10.1 概述氨基酸的應(yīng)用食品工業(yè)：食品工業(yè)： 強(qiáng)化食品強(qiáng)化食品：谷物中缺賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸、蛋氨酸。 增鮮劑：增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸。 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準(zhǔn)

2、,現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬(wàn)噸。10.1 概述氨基酸的應(yīng)用食品工業(yè)：食品工業(yè)： 大豆蛋白的氨基酸組大豆蛋白的氨基酸組成影響其營(yíng)養(yǎng)效價(jià)。成影響其營(yíng)養(yǎng)效價(jià)。 10.1 概述氨基酸的應(yīng)用醫(yī)藥工業(yè)：醫(yī)藥工業(yè)： 多種復(fù)合氨基酸制劑可通過(guò)輸液治療營(yíng)養(yǎng)或代謝失調(diào) 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對(duì)骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。10.1 概述氨基酸的生產(chǎn)方法 1、發(fā)酵法 （1）直接發(fā)酵 野生菌株 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變 抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株 抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株 （2）添加前體的發(fā)酵10.1 概述氨基酸的生產(chǎn)方法 2、酶法：利用酶來(lái)制造氨基酸。 3、提取法：蛋白質(zhì)水解液

3、中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 4、合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高,工藝復(fù)雜,難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。10.1 概述氨基酸的國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)概況 日本和德國(guó)為世界主要氨基酸生產(chǎn)國(guó)。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸，可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國(guó)、法國(guó)、中國(guó)等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家，生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。10.1 概述氨基酸的國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)概況 國(guó)內(nèi)生產(chǎn)主要氨基酸生產(chǎn)廠： 天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司 生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量與國(guó)外

4、大廠有較大差距。 在80年代中后期,我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)，1991年銷(xiāo)售量為二千萬(wàn)瓶，1996年達(dá)六千萬(wàn)瓶，主要廠家有無(wú)錫華瑞，北京費(fèi)森尤斯，昆明康普萊特，但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制發(fā)酵的環(huán)境條件 氨基酸發(fā)酵受菌種的生理特性和環(huán)境條件的影響，對(duì)專性需氧菌來(lái)說(shuō)環(huán)境條件的影響更大。 谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件的影響會(huì)引起發(fā)酵的轉(zhuǎn)換，生成各種不同的產(chǎn)物。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制溶解氧：溶解氧：乳酸或琥珀酸谷氨酸酮戊二酸 （通氣不足） （適中） （通氣過(guò)量、轉(zhuǎn)速過(guò)快）NH4+： 酮戊二酸谷氨酸谷酰胺 （缺乏） （適量） （過(guò)

5、量）pH： 谷酰胺，N乙酰谷酰胺谷氨酸 （NH4+過(guò)多） （中性或微堿性）磷酸：磷酸： 纈 氨 酸谷氨酸 （高濃度磷酸鹽）生物素：生物素： 乳酸或琥珀酸谷氨酸 （過(guò)量） （限量）10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制細(xì)胞滲透性 代謝產(chǎn)物的細(xì)胞透性是氨基酸發(fā)酵的重要因素，只有使細(xì)胞內(nèi)的氨基酸滲透到細(xì)胞外，才能大量積累氨基酸。 （1）生物素、油酸和表面活性劑，引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改變。 （2）青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓的差異使谷氨酸泄漏出來(lái)。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制旁路代謝 例如：L異亮氨酸的生物合成可由L蘇氨酸改為D蘇氨酸途徑，即采用旁

6、路代謝。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛?控制反饋?zhàn)饔梦餄舛龋朔答佉种坪妥瓒?，使氨基酸的生物合成反?yīng)能夠順利進(jìn)行。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用，是通過(guò)使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法來(lái)進(jìn)行。 例：利用抗性突變株消除S（氨基乙酸）L半胱氨酸（即AEC）（賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物）與L蘇氨酸的協(xié)同抑制。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制促進(jìn)ATP的積累，增加氨基酸的生物合成 氨基酸的生物合成需要能量，ATP的積累可促進(jìn)氨基酸的生物合

7、成。 10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基pH溫度氧10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 1、碳源：、碳源： 淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度要適當(dāng)，避免碳源濃度過(guò)高，否則對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。 菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 2 2、氮源：、氮源： 銨鹽、尿素、氨水；同時(shí)調(diào)整pH值。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要添加有機(jī)氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。 尿素滅菌時(shí)分解或形成磷酸銨鎂鹽，須單獨(dú)滅菌，40的尿素可在108 40min，高溫會(huì)生產(chǎn)縮脲。 氨水用pH自動(dòng)

8、控制連續(xù)流加10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 3 3、碳氮比、碳氮比 氮源除用于菌體生長(zhǎng)外，還用于氨基酸合成，在氨基酸發(fā)酵中常常是用氨水、尿素來(lái)調(diào)節(jié)pH，所以氨基酸發(fā)酵所用的C/N比一般微生物發(fā)酵的低，或者說(shuō)氮源用量更高。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 3 3、碳氮比、碳氮比 谷氨酸發(fā)酵在C/N大于100:11才開(kāi)始積累谷氨酸，所以發(fā)酵的C/N為100:(1530)。 合成菌體使用36的氮源；合成谷氨酸用去3080氮源。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基4 4、NHNH4 4+ +濃度：濃度：過(guò)低增加-酮戊二酸積累，過(guò)高使谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷酰胺。5 5、磷酸鹽：、磷酸鹽：對(duì)發(fā)酵有顯著影

9、響。不足時(shí)糖代謝受抑制。6 6、鎂：、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。7 7、鉀：、鉀：促進(jìn)糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長(zhǎng)。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基8 8、鈉：、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時(shí)加入。9 9、錳：、錳：是許多酶的激活劑。1010、鐵：、鐵：是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性基的組成分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。1111、銅離子：、銅離子：對(duì)氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基生長(zhǎng)因子：生長(zhǎng)因子：生物素 作用：影響細(xì)胞膜透性和代謝途徑。 濃度：過(guò)多促進(jìn)菌體

10、生長(zhǎng)，氨基酸產(chǎn)量低。過(guò)少菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)。 與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過(guò)量時(shí)，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。 種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來(lái)源。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制pH對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 作用機(jī)理：作用機(jī)理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 控制控制pHpH方法方法：流加尿素和氨水 流加方式：流加方式：根據(jù)菌體生長(zhǎng)、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制pH對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 控制：控制： （1）菌體生長(zhǎng)或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，避免pH過(guò)高 （2）菌體生長(zhǎng)或耗糖過(guò)快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長(zhǎng)。 （

11、3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時(shí)，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。 （4）氨水對(duì)pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制溫度對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制菌體生長(zhǎng)達(dá)一定程度后再開(kāi)始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長(zhǎng)最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。谷氨酸前者3032C，后者3437C。菌體生長(zhǎng)階段溫度不宜過(guò)高，否則菌體易衰老，pH增高，糖耗減慢，酸產(chǎn)量低。當(dāng)菌體生長(zhǎng)溫度過(guò)高時(shí)：要減少通風(fēng)量，少量多次流加尿素，來(lái)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。發(fā)酵中后期：維持合成溫度，以利氨基酸合成。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制氧對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：要求供氧充足的谷氨酸

12、族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。適宜在缺氧條件下進(jìn)行的亮氨酸、苯丙氨酸和適宜在缺氧條件下進(jìn)行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時(shí)產(chǎn)量最大。供氧不足時(shí)產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基供氧不足時(shí)產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵酸發(fā)酵10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸生產(chǎn)概述起初工業(yè)化生產(chǎn)采取小麥或大豆蛋白質(zhì)水解制取。1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)節(jié)調(diào)控水平。目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。我國(guó)現(xiàn)有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá)15萬(wàn)噸，居世界首位。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸產(chǎn)生菌株特

13、點(diǎn)革蘭氏陽(yáng)性不形成芽胞沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)需要生物素作為生長(zhǎng)因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸生物合成機(jī)理 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進(jìn)行還原性氨化作用而得到。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝淀粉的酸水解工藝1 1、調(diào)漿：、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。2 2、糖化：、糖化：蒸汽加熱、加壓糖化25min。3 3、中和：、中和：冷卻至80，燒堿中和至pH4.0-5.0（避免產(chǎn)生焦糖又保證過(guò)濾，中和為沉淀膠體）。4 4、脫色：、脫色：活性炭脫色和脫色樹(shù)脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8，在70及酸性條件

14、下攪拌后過(guò)濾。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝淀粉的酶法糖化工藝 以大米或碎米為原料時(shí)采用大米浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，pH6.0，加細(xì)菌-淀粉酶在85 下液化30min，加糖化酶60糖化24h，過(guò)濾后可供配制培養(yǎng)基。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝糖蜜原料 不宜直接用來(lái)作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 預(yù)處理方法：活性炭或樹(shù)脂吸附和亞硝酸法破壞以減少糖蜜中的生物素。 也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加青霉素。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 1 1、斜面培養(yǎng)：、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。 我國(guó)各工廠目前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘

15、變株。生長(zhǎng)特點(diǎn)：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長(zhǎng)因子。 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32培養(yǎng)18-24h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 2 2、一級(jí)種子培養(yǎng)：、一級(jí)種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH 6.56.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培養(yǎng)12h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3 3、二級(jí)種子培養(yǎng)：、二級(jí)種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 進(jìn)行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，無(wú)雜菌或噬菌體污染，菌體大小

16、均一，呈單個(gè)或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109 /ml。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵 1 1、適應(yīng)期：、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使該期縮短。 2 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降；溶氧急劇下降后維持在一定水平；菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形；不產(chǎn)酸；12h。措施：措施：采取流加尿素辦法及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)pH在7.5-8.0；維持溫度30- 3210.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵 3 3、菌體生長(zhǎng)停止期：、菌體生長(zhǎng)停止期：谷氨酸合成，糖和尿素分解產(chǎn)生-酮戊二

17、酸和氨用于合成谷氨酸。措施：措施：及時(shí)流加尿素以提供足夠的氨并使pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37 。 4 4、發(fā)酵后期：、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀４胧捍胧籂I(yíng)養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時(shí)，及時(shí)放罐。 發(fā)酵周期一般為30h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （1 1）生物素：）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響磷酯的合成。當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過(guò)量，則發(fā)酵過(guò)程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多10.4

18、谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （2 2）種齡和種量的控制）種齡和種量的控制 一級(jí)種子控制在11-12h，二級(jí)控制在7-8h。接種量為1。過(guò)多，菌體嬌嫩，不強(qiáng)壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （3 3）pHpH 發(fā)酵前期，幼齡細(xì)胞對(duì)pH較敏感，pH過(guò)低，菌體生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長(zhǎng)菌不長(zhǎng)酸。 谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH 7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過(guò)高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過(guò)低氨離子不足10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （4 4）通風(fēng)：）通風(fēng)：不同種齡、種量，培養(yǎng)基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風(fēng)量不同。 在長(zhǎng)菌體階段，通風(fēng)量過(guò)大，生物素缺乏，抑制菌體生長(zhǎng)。 在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風(fēng)供氧，以防過(guò)量生成乳酸和琥珀酸，但過(guò)大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸的提取 1 1、等電點(diǎn)法：、等電點(diǎn)法：操作簡(jiǎn)單，收率60。周期長(zhǎng)，占地面積大。 2 2、離子交換法：、離子交換法：用陽(yáng)離