HPLC含量測定分析方法驗(yàn)證中數(shù)據(jù)可接受標(biāo)準(zhǔn)討論.

1、HPLC 含量測定分析方法驗(yàn)證中數(shù)據(jù)可接受標(biāo)準(zhǔn)討論在進(jìn)行質(zhì)量研究的過程中，一項(xiàng)重要的工作就是要對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所涉及到的分 析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以保證所用的分析方法確實(shí)能夠用于在研藥品的質(zhì)量控 制。為規(guī)范對各種分析方法的驗(yàn)證要求，中國藥典2005 年版附錄規(guī)定了分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則。該指導(dǎo)原則對需要驗(yàn)證的分析方法及驗(yàn)證的具體指標(biāo)做了比較詳 細(xì)的闡述。但是文中未涉及各具體指標(biāo)在驗(yàn)證時(shí)的可接受標(biāo)準(zhǔn)，國際上已頒布的指 導(dǎo)原則中也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的要求。另一方面，大多數(shù)藥品研發(fā)單位在進(jìn)行質(zhì)量研究 時(shí)，已逐步認(rèn)識(shí)到分析方法驗(yàn)證的必要性與重要性，大都也在按照指導(dǎo)原則的要求 進(jìn)行分析方法驗(yàn)證，但驗(yàn)證完后卻因沒有一

2、個(gè)明確的可接受標(biāo)準(zhǔn)，而難以判斷該分 析方法是否符合要求。本文提出了在對 HPLC 含量測定方法進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)的可接受 標(biāo)準(zhǔn)，供大家討論。1 準(zhǔn)確度該指標(biāo)主要是通過回收率來反映。驗(yàn)證時(shí)一般要求分別配制濃度為80 %、100%和 120%的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實(shí)測值與理論值比較， 計(jì)算回收率?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為： 各濃度下的平均回收率均應(yīng)在98.0%-102.0%之間，9 個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD ）應(yīng)不大于 2.0%。2.線性線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗(yàn)證方法為:在 80%至 120%的濃度范圍內(nèi)配制 5 份濃度不同的供試液，分別測定其主峰的 面積，計(jì)算相應(yīng)的含

3、量。以含量為橫坐標(biāo)（X ），峰面積為縱坐標(biāo)（丫），進(jìn)行線 性回歸分析?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R ）不得小于 0.998,丫軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的 2%以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%3 精密度1）重復(fù)性配制 6 份相同濃度或分別配制濃度為 80%、100%和 120%的供試品溶液各三 份的供試品溶液，由一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測試，所得6 份供試液含量的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于 2.0%。2）中間精密度配制 6 份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個(gè)分析人員使用不同的儀器與試劑 進(jìn)行測試，所得 12 個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于 2.0%。4 專屬性可接受的標(biāo)準(zhǔn)為

4、：空白對照應(yīng)無干擾，主成分與各有關(guān)物質(zhì)應(yīng)能完全分離，分 離度不得小于 2.0。以二極管陣列檢測器進(jìn)行純度分析時(shí)，主峰的純度因子應(yīng)大于 980。5 檢測限主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于3。6 定量限主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于10。另外，配制 6 份最低定量限濃度的溶液，所測 6 份溶液主峰的保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。7 耐用性分別考察流動(dòng)相比例變化5%、流動(dòng)相 pH 值變化0.2、柱溫變化5C、流速 相對值變化 吃 0%時(shí)，儀器色譜行為的變化，選擇至少三個(gè)不同廠家或不同批號(hào)的 同類色譜柱，每個(gè)條件下各測試兩次?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為：主峰的拖尾因子不得大于2.0,主峰與雜質(zhì)峰必須

5、達(dá)到基線分離，分離度應(yīng)大于1.5;各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于 2.0%。8、系統(tǒng)適應(yīng)性配制6份相同濃度的供試品溶液進(jìn)行分析， 主峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于 2.0%，主峰保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于 1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大 于 2.0,主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離，分離度應(yīng)大于1.5,供試品主峰的理論塔板數(shù)應(yīng)取耐用性試驗(yàn)不同廠家或不同批號(hào)的同類色譜柱的平均值的100%-120%。高效液相色譜法(HPLC色譜法是一種應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛的分離分析技術(shù)，它已有近百年的發(fā)展史。二十世紀(jì)五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC 技術(shù)大發(fā)展，而七、八十年代生命科學(xué)、生

6、化、制藥工業(yè)的發(fā)展推動(dòng)了HPLC 的迅速發(fā)展。目前除分析化學(xué)外，生物化學(xué)，石油化學(xué)，有機(jī)化學(xué)，無機(jī)化學(xué)等學(xué)科都普遍 采用色譜技術(shù)?，F(xiàn)代高效液相色譜儀，以其高效，快速和自動(dòng)化等特點(diǎn)成為當(dāng)代分 析儀器中發(fā)展最快的儀器。HPLC 已成為操作方便、準(zhǔn)確、快速并能解決困難分離 問題的強(qiáng)有力的分析手段。 適用范圍廣：已知有機(jī)物中僅 20%不經(jīng)預(yù)先化學(xué)處理，可用 GC 分析；而其余 80%有機(jī)物 可用HPLC 分析。HPLC 適于分離生物、醫(yī)學(xué)大分子和離子化合物，不穩(wěn)定的天然 產(chǎn)物，種類繁多的其它高分子及不穩(wěn)定化合物。一次性使用醫(yī)療用品環(huán)氧乙烷殘留量測試方法G1 測試目的以此確定產(chǎn)品消毒后啟用時(shí)間，當(dāng)產(chǎn)品原

7、料與消毒工藝改變時(shí)應(yīng)予測試。G2 樣品米集于環(huán)氧乙烷滅菌后，立即從同一消毒批號(hào)的三個(gè)大包裝中隨機(jī)抽取一定量小包 裝樣品，采樣量至少應(yīng)夠作兩次測試用。分別于環(huán)氧乙烷滅菌后 24h 及以后每隔數(shù)天進(jìn)行殘留量測定，直至殘留量降至 4.2條所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值以下為合格。G3 儀器操作條件儀器：氣相色譜儀，氫焰檢測器。操作條件：柱：Chromosorb W.HP，80 目；玻璃柱長 2m，直徑 3mm。柱溫：120C。檢測器：150C。氣化：150C。載氣量： 氮?dú)猓?35mL/min ;氫氣：35mL/min;空氣：350mL/min。柱前壓：108kPa。G4 操作步驟G4.1 標(biāo)準(zhǔn)配制用 100mL

8、玻璃針筒從純環(huán)氧乙烷小鋼瓶中抽取環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣（重復(fù)放空二 次，以排除原有空氣），塞上橡皮頭，用 10mL 針筒抽取上述 100mL 針筒中純環(huán) 氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣 10mL，用氮?dú)庀♂尩?100mL （可將 10mL 標(biāo)準(zhǔn)氣注入到已有 90mL氮?dú)獾膸鹌と^的針筒中來完成）。用同樣方法根據(jù)需要再逐級(jí)稀釋23 次（稀釋 100010000 倍），作三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體。按環(huán)氧乙烷小鋼瓶中環(huán)氧乙烷 的純度、稀釋倍數(shù)和室溫計(jì)算出最后標(biāo)準(zhǔn)氣中的環(huán)氧乙烷濃度。計(jì)算公式為：式中：c 標(biāo)準(zhǔn)氣體濃度，卩 g/mLK 稀釋倍數(shù)；t室溫。G4.2 樣品處理至少取 2 個(gè)最小包裝產(chǎn)品，將其剪碎，隨機(jī)精確稱取 2g，放入

9、萃取容器中， 加入5mL 三氯甲烷或丙酮，充分搖勻，放置 4h 或振蕩 0.5h 待用。G4.3 分析待儀器穩(wěn)定后，在同樣條件下，環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣體各進(jìn)樣0.5 卩 L 待分析樣品各進(jìn)樣 2 卩 L。根據(jù)保留時(shí)間定性，根據(jù)基線構(gòu)成之面積稱峰面積。A =XcX卻2.507chh 1.064 Wh/2h峰面積（或峰高）進(jìn)行定量計(jì)算。G4.4 計(jì)算以所進(jìn)環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣的微克（卩 g）數(shù)對所得峰面積（或峰高）作環(huán)氧乙烷 工作曲線。 以樣品中環(huán)氧乙烷所對應(yīng)的峰面積 （或峰高） 在工作曲線上求得環(huán)氧 乙烷的量 A（卩g）,并以式（G2）求得產(chǎn)品中環(huán)氧乙烷的殘留量。式中：X 產(chǎn)品中環(huán)氧乙烷殘留量 卩 g/gA

10、 從工作曲線中所查得之環(huán)氧乙烷量，卩 g所取樣品量，g ;V 萃一一萃取液體積，mL ;V 進(jìn)進(jìn)樣量，mL。一次性輸液（血器環(huán)氧乙烷殘留量檢驗(yàn)方法探討本產(chǎn)品關(guān)鍵字：一次性輸液血器環(huán)氧乙烷殘留量檢驗(yàn)方法探討，資料，技術(shù)文 章，說明，一次性輸液血器環(huán)氧乙烷殘留量檢驗(yàn)方法探討圖片一次性輸液（血器已被廣泛應(yīng)用于臨床，國標(biāo) GB83688369-93 附錄 C 補(bǔ)充件 又規(guī)定了環(huán)氧乙烷殘留量的比色測定法。其操作方法的最后部分規(guī)定“，用蒸餾水稀釋至 10ml,室溫放置 1h,于 560nm 波長處測定吸光度，繪制吸光度-濃度曲線?！?我們在近 2 年多來的檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，室溫下放置時(shí)室內(nèi)溫度的高低對檢驗(yàn)結(jié)

11、果影 響很大。室溫在 15C以上時(shí)，放置 1h 后，標(biāo)準(zhǔn)曲線管與樣品管明顯出現(xiàn)顯色反 應(yīng)，比色測定結(jié)果穩(wěn)定。室溫在 15C以下時(shí)，特別是 10C以下放置 1h,標(biāo)準(zhǔn)曲線 管與樣品管幾乎無顯色反應(yīng)，繼續(xù)放置 1h,時(shí)，顯色反應(yīng)仍不明顯，測定結(jié)果含量 偏低。而顯色反應(yīng)受溫度的影響，溫度越高，顯色越快，反之，顯色慢。為此，當(dāng) 室溫在 15C以下的，采用恒溫水?。?8C放置 1h，得滿意結(jié)果。1 儀器與材料7520 型分光光度計(jì)（上海分析儀器廠。一次性輸液（血器（常熟市醫(yī)用器材廠。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果取同一廠家輸液（血器 10 批，依法操作，按規(guī)定環(huán)氧乙烷殘留量不得超過0.5mg,結(jié)果見附表。附表不同溫度下的檢驗(yàn)結(jié)果（mg編號(hào)6C恒溫水?。?8C室溫（25C1 0.04 0.23 0.232 0.06 0.25 0.253 0.05 0.24 0.254 0.04 0.23 0.235 0.03 0.21 0.206 0.05 0.23 0.247 0.04 0.23 0.228 0.05 0.24 0.25