實驗報告目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)化及工程菌導入表達并PCR驗證

1、題目：目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)化及工程菌導入表達并PCR驗證實驗?zāi)康?1. 學習目的基因連接轉(zhuǎn)化載體的原理和方法。2. 學習制備感受態(tài)細胞并將質(zhì)粒導入工程菌的原理和方法。3. 學習菌落PCR鑒定陽性克隆的方法和步驟實驗原理1. DNA的連接重組:具有相同粘性末端的兩段 DNA分子在DNA連接酶的作用下可以連接在一起。因為相同的 粘性末端同一通過堿基互補配對形成一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。連接溫度的選擇，理論上的最適 溫度是連接酶的最適溫度-37攝氏度，但是該溫度下粘性末端形成的配對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以 在室溫下（1216度）既可最大限度發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。2. 感受態(tài)細胞的制備:將快

2、速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0C）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞 膨脹，同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分 核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞，細胞膜通透性發(fā)生變化，極易 與外源DNA相粘附并在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物。聯(lián)合其它的二價金屬離子（如 Mn Co）、DMS（或還原劑等物質(zhì)處理細菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高 100 1000 倍。3. 質(zhì)粒的導入在冰上融化感受態(tài)細胞，經(jīng)過42度短暫熱激后，由于細胞膜處于液晶態(tài)產(chǎn)生裂縫，外源DNA黏附于細胞表面，而后立即冰浴，促使細胞膜愈合。然后將菌體放入適宜的培養(yǎng)基

3、中培養(yǎng)，以促進細胞的愈合恢復。4陽性轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基篩選方法。普通的大腸桿菌難以在含有Kana的LB培養(yǎng)基上存活繁殖，但由于載體質(zhì)粒含有 Kana霉 素的抗性基因，所以成功導入載體質(zhì)粒的大腸桿菌能夠在含有Kana的LB培養(yǎng)基上形成菌落，即轉(zhuǎn)化陽性，但是由于成功導入的質(zhì)粒不一定攜帶了目的基因，所以可能會出現(xiàn)偽陽 性，故需要進行PCF鑒定。5.菌落PCR的原理通過目的基因的引物進行菌落 PCR如果菌體成功導入了目的基因，則能夠通過 PCF獲 取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不會擴增出目的基因片段。從而將陽性與偽 陽性菌落區(qū)分開。三. 實驗材料及設(shè)備1. 實驗材料：(1) 已完成酶切的載體與目

4、的基因片段。DNA連接酶，緩沖液等。(2) 冰凍的感受態(tài) DH5a大腸桿菌。2. 實驗儀器：(1) 恒溫搖床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，10、100、1000卩L取液 器各一支，臺式高速離心機，制冰機，漩渦器；(2) 電泳儀，電泳槽，樣品槽模板(梳子)，有機玻璃內(nèi)槽，水平儀， 取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。(3) PCR儀3.實驗試劑：(1 )質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化導入a. DNA連接酶d.酶切后的pET28a、目的基因片段等。b. lOXbuffer;c. 卡那霉素；e丄B培養(yǎng)液:胰蛋白胨(Tryptone )10g,酵母提取物(Yeast extract )5g，NaCI5g，瓊脂(固體培養(yǎng)基)1

5、5g，用 1N NaOH調(diào) pH7.5;(2) DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a. Gold view( DNA染 料)b. 1 x TAE緩沖液c. 上樣緩沖液(6x buffer )(3) PCRa. loading bufferb. 四種脫氧核糖核苷酸原料、Taq酶、上下游引物c. ddH2O四. 實驗方法及步驟實驗流程圖離心收豪就陣TSmtco-a-CaCljPCR鑒定菌落載體質(zhì)粒與目的基因連接轉(zhuǎn)化1. 質(zhì)粒的連接轉(zhuǎn)化a）在EP管中分別配置下列的體系:0.2ml EP 管10X buffer2.5 yL酶切后的pET-28a7.5 yL酶切后的目的基因片段13 yLT4DNA連接酶（考慮連接

6、效率）2 y LX : 丫 = 1 : 1030,總體積25卩Lb）EP管中液體混勻后瞬時離心，放入培養(yǎng)箱20 C下保存?zhèn)溆谩?2 C 反應(yīng) 30min ,-2. 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的導入a）取出感受態(tài)細胞 DH5a讓其在冰上自然解凍， 每100卩L解凍的感受態(tài)細胞加入整管連接產(chǎn)物，混勻后冰浴30min。b）42 C熱沖擊45秒，立即置于冰浴5min。c）熱激法：使用化學試劑（如 CaCI2）制備的感受態(tài)細胞，細胞膜 通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA想粘附并在細胞表面形成脫氧核糖酸酶的羥基-磷酸鈣復合物。此時，將該體系轉(zhuǎn)移到420C下做短暫的熱刺激，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈運動，并隨機出 現(xiàn)許多間隙，

7、外源 DNA就可能被細胞吸收；d）冰浴過程中不要搖動 EP管；（使破裂的菌體自然恢復）e）再在感受態(tài)細胞混合物中加入0.8mL的LB培養(yǎng)基，于37C搖床中培養(yǎng)1h。目的：使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；f）涂布于含有kana的LB固定培養(yǎng)基表面，37 C培養(yǎng)過夜3. PCR鑒定假陽性1.在0.2mL EP管內(nèi)配制25卩L PCR反應(yīng)體系1個:實驗室沒有MgCI2,但是Buffer 中含有Mg2+,所以實際添加 18.5+1.5=20 卩 L 的 ddH2O;PCR單管加樣時，對于非常微量反應(yīng)物體積（卩L）ddH2O18.510 x Buffer2.5MgCj 21.54

8、x dNTP1引物10.5引物20.5Taq酶0.5菌落挑1個的樣品一定將樣品加于管壁上或者液體中，防止漏樣;加樣的順序：先加ddH2Q其次是緩沖液和菌落， 最后加酶，且要把 樣品加到液面下，酶從-200C冰箱中拿出后放在冰中待用， 加酶時槍 尖不要伸進酶液過深，加樣時在溶液中緩慢吹吸幾次，保證足夠的 酶量；2、用滅菌槍頭挑單菌落（在培養(yǎng)皿背面做好標記）接觸EP管內(nèi)，混勻瞬時離心，每組可做5個體系。由于反應(yīng)體系體積太小，引起的誤差較大，可以一次配置多個（比所需反應(yīng)體系個數(shù)多一個）反應(yīng)體系，然后分開；3、放入PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)程序: 94 C預(yù)變性5min ; 94 C變性30S;使雙鏈的DN

9、A模板解旋為單鏈； 55 C退火30S;引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； 72 C延伸60S;Taq酶以4種dNTP為原料，引物為復制起點，按 5'一 3方向，復 制模板的互補鏈； 重復步驟30次；(1) 新合成的DNA分子可以作為模板，參與后續(xù)的擴增反應(yīng)，使目 的分子呈指數(shù)增長。(2) 一般進行30個循環(huán)，因為此時目的分子的擴增進入平臺期； 72 C延伸10min;最后4C保藏。4. 跑膠驗證：膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負極），注入1 X TAE緩沖液淹沒 過膠板5mm用取液器將PCR產(chǎn)物5卩L與1卩L上樣緩沖液（6 X ）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。將電泳槽與電泳儀接通，

10、調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍色指示劑移動到距離膠板邊沿約12cm處，停止電泳。將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中 DNA存在處顯示出熒光條帶。五. 實驗結(jié)果菌落生長情況: 可以看到，左側(cè)的工程菌形成較多 菌落，而右側(cè)幾乎沒有生長，兩組工 程菌的差異主要在于熱激時長（受 錯誤實驗操作步驟影響，右側(cè)實驗 組2只熱激了 20s，而左側(cè)為正常 的 45s）菌落較小，且分布密集，說明菌液濃 度過高或者沒有搖勻。圖i平板工程菌生長情況(左實驗組1右實驗組2)PCR實驗結(jié)果Marker:DL2000A 帶：2000bpB 帶 1000bpC 帶

11、 750bpD 帶 500bpF 帶 250bpG 帶 100bp圖2菌落PCR凝膠電泳紫外熒光檢測結(jié)果說明：泳道編號依次為：1紅色熒光蛋白工程菌2綠色熒光蛋白工程菌3綠色熒光蛋白工程菌（老師提供），4 DL2000Maker所得條帶較為清晰，部分呈現(xiàn)“ U型”可能是電壓過高，膠板溫 度過高。泳道123都產(chǎn)生了長度約800bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果較為接近， 且GFP組的分子量大于 RFP組，與事實一致。證明所驗證的三個菌落 均為陽性菌落。老師所提供 GFP工程菌由于菌體較多，可見大腸桿菌 基因組條帶（3條帶1000bp到2000bp之間）泳道1的下方還出現(xiàn)了一條約 300bp的清晰條帶，可能是引

12、物因 為巧合而PCR擴增出的雜帶。六. 結(jié)果討論與結(jié)論:1. 實驗結(jié)論：通過DNA連接酶，我們將目的基因片段與載體質(zhì)?；旌?，再通過 熱激發(fā)，我們成功將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導入DH5a,并用含有Kana霉素的固體LB培養(yǎng)基驗證，證明所檢測的三個菌落都不是假陽性。2. 討論一：PCR一般循環(huán)重復2530次，重復次數(shù)過多會怎丿羊？答：溶重復次數(shù)過多，雖然在一定程度上能夠提高產(chǎn)物量，但是由于反應(yīng)時間過長，有一些非特異產(chǎn)物的擴增和堿基錯配數(shù)也會相應(yīng)增加；而且隨著酶的擴增能力下降，合成目標片段的能力也會隨之下降，也可能引起其他的非特異性擴增；此外還可能會 導致PCR反應(yīng)“平臺效應(yīng)”的出現(xiàn)3. 討論二：挑取單菌落的注意

13、事項有哪些？(1) 培養(yǎng)皿底部朝上，在酒精燈火焰20cm內(nèi)操作;(2) 操作時不要講話，在無風處操作；(3) 挑斑器具要求無菌;(4) 挑選遠離群菌落的單菌落，菌落不要過大；4. 討論三：2. Taq DNA聚合酶的特性和菌落 PCR的原理。Taq DNA聚合酶的特性：Taq DNApol具有5' 3'聚合酶活 性和3' 5'外切酶活性，但體外使用的 Taq酶無3' 5'外切 校正活性。Taq酶最大的特點是耐熱性； 另外還具有高的催化合成 特性。菌落PCR的原理：直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，可以快速鑒定菌落是否為含有目的基因的陽性菌落，此per的方法通常被用來進行篩選插入的目的基因或者DNA測序分析。最后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的片斷大小。5. 討論四：BL21與DH5a等感受態(tài)細菌特點及應(yīng)用的特征， 用處。(1) DH5a和BL21都可以作為表達宿主。(2) BL21是蛋白酶缺陷株，表達出來的蛋白不會被降解，做蛋白表達是比較適合用的，。BL21生長要比DH5a快，這是他們的又一區(qū)別， 在高密度發(fā)酵BL21表達蛋白時，需要控制它的表達條件，使得高密度且高表達。(3) DH5a復