實(shí)驗(yàn)六抗菌藥物的體外藥效試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)六、抗菌藥物的體外藥效試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn)) 各種病原菌對抗菌藥物的敏感性不同，同種細(xì)菌的不同菌株對同一藥物的敏感性有 差異，檢測細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，可篩選最有療效的藥物，用于臨床對控制細(xì)菌性 傳染病的流行至關(guān)重要。此外，通過藥物敏感試驗(yàn)可為新抗菌藥物的篩選提供依據(jù)。藥 敏試驗(yàn)的方法很多，普遍使用的有濾紙片擴(kuò)散試驗(yàn)( Kirby-Baueer Dice Diffusion )； 最低抑菌濃度試驗(yàn)( Minimum Inhibitory Concentration, MIC )和最低殺菌濃度試驗(yàn) ( Minimum Bactericidal Concentration, MBC )。目的要求1

2、、熟悉體外抗菌試驗(yàn)操作技術(shù)。2、掌握藥物抗菌能力體外測定的常用方法及其用途。實(shí)驗(yàn)原理 常用的體外測定藥物抑菌能力的方法有兩大類：瓊脂滲透法與濃度系列稀釋法。瓊 脂滲透法時利用藥物能夠滲透至瓊脂培養(yǎng)基的性能，將實(shí)驗(yàn)菌混入瓊脂培養(yǎng)基后傾注成 平板；或?qū)⒃囼?yàn)菌均勻涂于瓊脂平板的表面，然后用不同的方法將藥物置于已含試驗(yàn)菌 的瓊脂平板上。根據(jù)加藥的操作方法不同而有濾紙片法、打洞法、管碟法及挖溝法等。 經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后觀察藥物的抑菌能力。濃度系列稀釋法時把藥物稀釋成不同的系列濃 度，混入培養(yǎng)基內(nèi)，加入一定量的試驗(yàn)菌，經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后觀察結(jié)果，求得藥物的最 低抑菌濃度( MIC)。1、細(xì)菌 ：所用細(xì)菌應(yīng)包括

3、主要致病菌。革蘭氏陽性球菌包括金黃色葡萄球菌( 產(chǎn)酶與不產(chǎn)酶菌株 ) 、表皮葡萄球菌，鏈球菌、腸球菌等。革蘭氏陰性球菌如淋球菌等。革蘭 氏陰性桿菌包括流感桿菌、腸桿菌科細(xì)菌810種，綠膿桿菌與其它假單抱菌屬及不動桿菌屬等，厭氧菌包括脆弱類桿菌、消化球菌和消化鏈球菌等。對臨床應(yīng)用有代表性的 菌株數(shù)量，創(chuàng)新藥應(yīng)不小于 1000株。其它類新藥根據(jù)新藥抗菌譜寬窄可作 200-500株。 試驗(yàn)時應(yīng)包括有國際公認(rèn)質(zhì)控菌株(如金葡菌ATCC25925大腸桿菌ATCC2592和綠膿桿 菌 ATCC2785等)。2 、培養(yǎng)基： 選 MH(Muelkr-Hintop) 培養(yǎng)基。鏈球菌、流感桿菌需接種到巧克力瓊脂

4、平板或加 5羊血。淋球菌接種到哥倫比亞培 養(yǎng)基上。3 、藥物配制 ：試驗(yàn)樣品與陽性對照藥品均應(yīng)用稱重法求出效價并按鹽基比例折算出 實(shí)際效價。所試藥物用磷酸緩沖液或滅菌注射用水溶解，配制成溶液。少數(shù)難溶藥物可 加少許相應(yīng)助溶劑，再用緩沖液或滅菌注射用水稀釋至所需濃度。4、試驗(yàn)方法 ： 最小抑菌濃度 （MIC） 測定法，采用平皿或試管二倍稀釋法測無細(xì)菌生長平皿或 試管中所含藥物的最小濃度即為最小抑菌濃度。 最小殺菌濃度（MBC測定法，先測出MIC,再依次存未見細(xì)苗生長各管培養(yǎng)物 分別吸取，傾倒于平皿上， 37再培養(yǎng) 18小時，平皿上菌落數(shù)小于 5 個的最小 稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度。 殺菌

5、曲線（KCS實(shí)驗(yàn)，將所試菌液約105菌落計(jì)數(shù)單位（CFU/ml）與抗菌藥物混合，定量取樣于平皿培養(yǎng)基， 孵育后計(jì)算其活菌數(shù)， 并繪制出時間殺菌曲線。 實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)空白對照管與已知藥物對照試驗(yàn)。5、培養(yǎng)條件對MIC的影響： pH值的影響，將培養(yǎng)基的pH調(diào)整，測定藥物對所試細(xì)菌（臨床常見致病菌）12 株MIC的影響。 細(xì)菌接種量的影響，在其它條件不變時改變細(xì)菌接種量，比較不同菌量對MIC的 影響。 血清蛋白結(jié)合的影響： 如采用 25、 50、 75等不同的血清濃度與不含血清的培養(yǎng)基觀察血清含量對 MIC的影響。試驗(yàn)內(nèi)容（一）濾紙片法（圓紙片擴(kuò)散試驗(yàn)）材料 無菌平皿 1 只, 無菌 1ml 吸管 1 支

6、, 無菌小濾紙片 , 待檢藥（ 1 個平板可做 1種或多種藥物實(shí)驗(yàn)）,瓊脂培養(yǎng)基（瓶裝或定量分裝1520ml于大試管，滅菌，備用）， 實(shí)驗(yàn)菌肉湯培養(yǎng)基，鑷子， 95酒精等。方法 瓊脂培養(yǎng)基置于水浴中加熱融化，冷卻至50C左右，用無菌操作法吸取菌液（制備每只平板約需）加入瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，傾注于無菌平皿內(nèi)，素轉(zhuǎn) 動平皿使細(xì)菌均勻分布其中，水平放置待凝（也可預(yù)先在平皿中鋪一層瓊脂培 養(yǎng)基作底層，冷卻后再加一薄層含菌瓊脂培養(yǎng)基， 如此，可使抑菌圈更加清晰） 。 鑷子沾酒精后通過火焰，燒灼滅菌，反復(fù) 3次，鑷取無菌濾紙片，浸沾藥液， 貼于平板表面，各紙片間的距離藥大致相等。37 C培養(yǎng)一晝夜后，

7、觀察此濾紙片周圍有無抑菌圈，并量取其直徑。抑菌圈即無菌生長區(qū)，藥液在一定濃度 范圍內(nèi)，抑菌圈的大小表示抑菌作用的強(qiáng)弱。結(jié)果判定根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，來判斷該菌對各種藥物 的敏感程度。依次可分為：高度敏感，中毒敏感，低度敏感，不敏感四種。細(xì)菌對磺胺 類藥物的敏感度的標(biāo)準(zhǔn)，按 Hawking所定，若磺胺藥物濃度在每毫升10卩g即能抑制細(xì) 菌生長者，則該細(xì)菌對磺胺藥很敏感；如需每毫升 50卩g才能抑制生長，為敏感；每毫 升1000卩g才能抑制為中度敏感；每毫升超過 1000卩g仍不能抑菌者，則為耐藥菌株。（二）試管稀釋法材料菌種：金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物；培養(yǎng)基：普通肉湯；抗菌藥物

8、：含青 霉素64IU/ml ;其他材料：麥?zhǔn)媳葷峁?，滅? ml刻度吸管，橡皮膠頭，無菌試管。方法以葡萄球菌對青霉素的敏感性為例。將1ml/管排成一列，編上19的管號，在第一個管內(nèi)加入含64IU/ ml青霉素肉湯1 ml。混勻后吸取1 ml到第二管，混勻，再 取1 ml至第3管，以此類推至第八管。第 9管不含青霉素的肉湯做為對照管。然后每管 加入ml含菌當(dāng)量相當(dāng)于麥?zhǔn)媳葷峁艿?管1/2的金黃色葡萄球菌（相當(dāng)于億/ ml ），操 作術(shù)式見表試管號123456789藥物濃度（卩32168421g)肉湯（ml）青霉（ml）111 I11卜、'匸11卜.1卜1 1 11卜棄1ml細(xì)菌（ml）（

9、三）平板稀釋法材料無菌平皿，5 ml無菌吸管，1 ml無菌吸管，10 ml無菌吸管，無菌試管，待檢藥液，滅菌蒸餾水，緩沖液（pH依藥物穩(wěn)定性而定），實(shí)驗(yàn)菌肉湯培養(yǎng)物，瓊脂 培養(yǎng)基 （大試管定量分裝成9 ml/支）。方法1、細(xì)菌蒸餾水或緩沖液把待檢藥液配成一系列濃度梯度： 1：1，1：2，1：4，1：8， 1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，（方法同試管稀釋法中的二倍稀釋） 。2、將每種濃度的待檢藥液1 ML加入9ML50-55C瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻傾注于 無菌平板中，制成一系列藥物濃度遞減的平板。3、對照不加藥液，即將培養(yǎng)基直接傾入無菌平皿，待冷凝即成。4、將不同試驗(yàn)菌經(jīng)適

10、當(dāng)稀釋后， 點(diǎn)種再含藥平板及對照平板上， 接種量約為 10CFU/點(diǎn)（colony-forming unit,CFU菌落形成單位）。5、 37C培養(yǎng)1824小時后，觀察藥物對試驗(yàn)的最大稀釋度，再乘以10,得出最大 抑制稀釋度（即 MIC）。注意事項(xiàng)1 、實(shí)驗(yàn)中所用試管、吸管。棉簽、鑷子、紙片及各種藥液配制均應(yīng)無菌，并按照 生物實(shí)驗(yàn)常規(guī)進(jìn)行操作。2 、濾紙片法：到平板時，平板中瓊脂培養(yǎng)基的厚薄需均勻一致，以免影響抑菌圈大小。瓊脂板的厚度可影響抑菌圈的大小，一般為23mm制備含菌平板時，應(yīng)特別注意混入菌液時的溫度，不能太高，以免燒死細(xì)菌。菌液和培養(yǎng)基混合后應(yīng)迅速搖勻， 使均勻分布。培養(yǎng)溫度和時間以

11、 37 C、18小時最佳，要求溫度均勻。培養(yǎng)石匠過場可 能影響抑菌圈的清晰度。濾紙片沾取藥液時不要太多，以免再平板中流淌，影響抑菌 圈形狀和大小。3、試管稀釋法：稀釋的準(zhǔn)確性 每稀釋一種濃度換一支吸管，較一支吸管稀釋到 底準(zhǔn)確些。加入菌液的濃度 菌液濃度大時，則最小抑菌濃度藥高，反之亦然。菌 齡 一般認(rèn)為幼齡菌較敏感，所以多用細(xì)菌的 6 小時培養(yǎng)液。思考題1、怎樣判斷最后的結(jié)果時抑菌還是殺菌抑菌濃度大還是殺菌濃度大2、用試管稀釋法測定藥物的最低抑菌濃度時，主要有哪些因素影響試驗(yàn)結(jié)果3、如藥物是一種脂溶性或不太溶于水的物質(zhì)，是否也可以測定其最定抑菌濃度如可 以，如何進(jìn)行4、比較青霉素G鈉、慶大霉

12、素、丁胺卡那霉素、頭抱呋新、諾氟沙星在體外抑菌的 強(qiáng)弱。5、 體外篩選具有抗菌作用的藥物能否直接應(yīng)用于臨床為什么實(shí)驗(yàn)七、抗菌藥物的體內(nèi)藥效觀察在體外實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)抗菌作用的藥物還可能由于毒性大或體內(nèi)過程、代謝動力學(xué)等原因，在體內(nèi)發(fā)揮不出抗菌效果，需進(jìn)一步了解其對感染動物是否有效。體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)不僅測定敏感性，還包括影響新藥治療的其他的變化因素，如宿主反應(yīng)， 藥物到達(dá)感染部位的能力，藥物的滅活等。如果在體內(nèi)也有效，且毒性不大，才 有可能過渡到臨床，另外，還應(yīng)注意許多體外無抗菌作用的中草藥用于治療感染 性疾病可能會有較好療效。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)治療方法的基本過程；2、觀察青霉素的體內(nèi)抗菌作用及

13、ED50 的測定。實(shí)驗(yàn)材料1、 實(shí)驗(yàn)動物及選擇原則：小白鼠30只（1822g）;選用有合格證動物提供的健康小鼠，體重1822g，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組動物至少10只。2、 實(shí)驗(yàn)器材及藥品等：注射器（1ml）；小試管；試管架；MH培養(yǎng)基；金黃色 葡萄球菌液；5%胃膜素懸液；青霉案 G鈉；碘酊；70%乙醇；5%石炭酸溶液。3、感染菌種：根據(jù)所試藥物的抗菌作用特點(diǎn)選擇不同菌株進(jìn)行試驗(yàn)。常用致 病菌如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、腸桿菌、氏肺炎桿菌、桿菌、痢疾桿菌、 傷寒桿菌、綠膿桿菌等。試驗(yàn)廣譜抗生素時感染菌株應(yīng)包括金葡菌與革蘭氏陰性菌各 l 2 種。創(chuàng)新與陰性菌均需作 2 種以上，每一種菌 2 株

14、以上，并包括有臨床 分離的致病菌。方法1、菌液制備：將保存的金黃色葡萄球菌接種 MH培養(yǎng)基中，于37C培養(yǎng)，16-18小時。用平皿表面計(jì)數(shù)法測定實(shí)驗(yàn)感染用的活菌數(shù) （如條件一致，則不必每次測定）。將上述菌液用生理鹽水以10倍順序稀釋為10-1、10-2、10-3等不同濃度 菌液；再取此不同濃度的菌液1ml加5%胃膜素懸液9ml。即做成濃度力10-2 >10-3、10-4的菌懸液用。2、 預(yù)試驗(yàn)：將不同濃度的菌懸液分別腹腔注射于35只小鼠，每只，觀察其死、ED5o 和亡情藥物名劑 量對數(shù)劑量動物數(shù)死亡動物數(shù)、95 %況。正 稱（mg/Kg）X（只）（只）可信限式實(shí)受試藥驗(yàn)時物選用對照藥最小

15、物致死 量，即感染后引起小鼠 80-100 %死亡的菌液濃度進(jìn)行感染。常用的病菌的參考用量見本實(shí)驗(yàn)附錄。肺炎鏈球菌和鏈球菌的腹腔感染可不用胃膜素稀釋，而是將在 血清MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18小時的菌液腹腔注射，觀察 24-48動物死亡情況。 感染菌量：感染前需先測出所試菌株的最小致死量（MLD）,即能引起80-00 %動物死亡的菌液濃度）作為感染菌量。 感染途徑：菌源液用5 %胃膜素（或干酵母）稀釋至所需濃度，經(jīng)腹腔或尾靜脈注射相當(dāng)于100%致死量的菌液感染小鼠。3、實(shí)驗(yàn)治療：取1822g的小鼠30只。雌雄均可，雌者須無孕。按性別體重隨機(jī)分為6組，每組10只。用預(yù)試中選定并適當(dāng)稀釋的菌懸液，每

16、鼠腹腔注射，以感染各組小鼠。第1-5組于感染的同時及感染后 6小時肌內(nèi)注射不同劑量青霉素，劑量分別為20萬u> 40萬u> 9. 8萬u萬u萬u/Kg體重（亦可實(shí)驗(yàn)前根 據(jù)細(xì)菌敏感情況調(diào)整用量 ） 。連續(xù)觀察 7 天，記錄各組小鼠死亡情況。計(jì)算半數(shù)有 效量數(shù)（ED50）及95%可信限。實(shí)驗(yàn)必需設(shè)不給藥組與已知同類藥物陽性對照組。注意事項(xiàng)1、本實(shí)驗(yàn)須按照生物實(shí)駐中處理感染動物常規(guī)進(jìn)行，嚴(yán)防菌液污染。2、實(shí)驗(yàn)樣結(jié)束后，應(yīng)將全部接種過菌液的動物不淪死活進(jìn)行焚化或丟入置有 5%石炭酸溶液的缸內(nèi)，用肥皂洗手后用碘酊及酒精擦手，以防傳播疫病。報告要點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果按下表填寫并計(jì)算該藥的半數(shù)有效量（E

17、D50）及95%可信限。并根據(jù)其半數(shù)致死量計(jì)算治療指數(shù)。治療指數(shù) =LD50/ED50思考題1、抗菌藥物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)包括哪些基本步驟應(yīng)如何進(jìn)行2、治療指數(shù)有何意義附 1： 5 %胃膜素懸液制備法稱取胃膜素 5g 放于研缽內(nèi)，加少量生理鹽水研磨，邊研邊加水，最后加至100ml，于10磅加壓10分鐘滅菌即可。臨用時調(diào)整其 pH至中性。附 2 ：活菌數(shù)測定法將培養(yǎng)基的菌懸液依 10倍順序稀釋使其濃度為 10-1， 1 0-2、1 0-3、 1 0 -（即 以9ml無菌生理鹽水加1ml菌懸液為10-1，依次累推）選求適當(dāng)濃度的菌懸液放在 MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，輕輕推幵菌液，注意不要碰到平板邊緣，以免影響計(jì)數(shù)。 共作作3個平皿，都放入37C孵箱，培養(yǎng)1820小時后計(jì)算菌落群數(shù)。平板玻璃 蓋可換為瓦蓋 （ 因瓦改能吸水，