水和飲料中細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群的測(cè)定

1、1 / 8水和飲料中細(xì)困總數(shù)和總大腸困群的測(cè)定1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1學(xué)習(xí)水樣的采取方法、了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理 和測(cè)定意義。1.2學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。1.3學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。2、實(shí)驗(yàn)原理2.1水中細(xì)菌總數(shù)可說明被有機(jī)物污染的程度，細(xì)菌數(shù)越多，有機(jī)物質(zhì)含量 越大。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣在牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基中，37 C經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算 的是平板上形成的菌(colony-forming unit , cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。 它反映的是檢樣中活菌

2、的數(shù)量。2.2所謂大腸菌群，是指在37C、24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧 的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屆內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屆、檸檬酸桿菌屆、克雷伯氏菌屆和腸桿菌屆。水的大腸菌群數(shù)是指100mL檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值， 以大腸菌群 最近似數(shù)(MPN)ft示。2.3水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn) 用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于自來(lái)水和深井 水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。多管發(fā)酵法 包括：初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。2.3.1初發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白月東液

3、體培養(yǎng)基，并倒置一德漢式小套管。乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)基 內(nèi)加漠甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基由紫變黃。發(fā)酵管經(jīng)37C培 養(yǎng)24h,小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基渾濁，顏色改變，說明說中存在大腸 菌群，為陽(yáng)性結(jié)2 / 8果。但是，有個(gè)別其他類型的細(xì)菌此條件下可能產(chǎn)氣，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管，也不一定非大腸菌群，因其也可能延遲48小時(shí)才產(chǎn)氣，這兩種情況應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此需繼續(xù)進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)，才能確定是否為大腸菌群。48小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2.3.2平板分離伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅和美藍(lán)染料， 在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳

4、糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、 有金屆光澤的深紫色菌落。初發(fā)酵管24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需 在以上平板上劃線分離，培養(yǎng)后，將符合大腸菌群菌落特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染 色，只有染色為革蘭氏陰性、無(wú)芽抱桿菌的菌落，才是大腸菌群菌落。2.3.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)將以上證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的菌落，接種復(fù)發(fā)酵，其原理與初發(fā)酵相同，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸乂產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結(jié)果。根據(jù)確定有大腸菌群存 在的初發(fā)酵管數(shù)目，查閱專用統(tǒng)計(jì)表，得出總大腸菌群指數(shù)。3、實(shí)驗(yàn)器材3.1培養(yǎng)基3.1.1普通乳糖蛋白月東培養(yǎng)液蛋白月東10g，牛肉膏3g，乳糖5g,氯化鈉5g ,

5、 1.6%漠甲酚紫乙醇液1.0mL,蒸僧水1000mL, pH 7.27.4。將蛋白月東、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸僻水中，調(diào)節(jié)pH為7.27.4，再加入1.6%漠甲酚紫乙醇液1.0mL,充分混勻，分裝于有德漢氏 小管的試管中，每管10mL 115C滅菌20min。3.1.2三倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液按上述普通乳糖蛋白月東培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有德漢氏小管的試管中，每管5mL3.1.3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EME養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用）3 / 8蛋白月東10g,乳糖10g,險(xiǎn)HP（42.0g，瓊脂20g，蒸僻水1000mL 2%伊紅（曙 紅）水溶液20mL, 5%美藍(lán)（業(yè)甲

6、藍(lán)）水溶液13mL pH 7.27.4。3.2溶液和試劑自來(lái)水、奶茶、池塘水、革蘭氏染色液、無(wú)菌水等3.3儀器和其他用品顯微鏡、載玻片、滅菌三角瓶、滅菌帶塞空瓶、滅菌移液管、滅菌試管、德 漢氏小管、滅菌培養(yǎng)也。4、操作步驟4.1水樣的采集：4.1.1自來(lái)水：先將自來(lái)水龍頭用火焰灼燒3分鐘滅菌，再開放水龍頭使 水流五分鐘后，在火焰旁打開滅菌三角燒瓶瓶塞，接取水樣以備分析。4.1.2池塘水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅 菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶 中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觥?.1.3奶茶：在無(wú)菌操作下，將已封閉的飲

7、料打開，在火焰旁用三角瓶取 樣，并迅速進(jìn)行分析4.2水樣中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)4.2.1自來(lái)水中細(xì)菌總量的檢測(cè)4.2.1.1用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做兩個(gè)平 也。4.2.1.2分別傾注約15ml已溶化并冷卻到45度左右的牛肉膏蛋白月東 瓊脂培養(yǎng)基，并立即放在平整的桌面上，做平面旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，使水樣與培養(yǎng)基充分 混勻。4.2.1.3另取一滅菌培養(yǎng)血，不加水樣，傾注牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基15ml,做空白對(duì)照。4.2.1.4培養(yǎng)基凝固后，倒置于37度，培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)，即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。4 / 84.2.2水樣稀釋及培養(yǎng)：4.2.2.1按無(wú)菌操

8、作法，將水樣按10倍稀釋法稀釋。4.2.2.2根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)， 選擇2-3個(gè)適宜稀釋度 （奶茶選 擇1: 10、1: 100、1: 1000;池塘水選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度）， 吸取1mL稀釋液于滅菌平血內(nèi)，每個(gè)稀釋度作2個(gè)重復(fù)。4.2.2.3將熔化后保溫度45C的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基倒平也，每 也約15mL并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。4.2.2.4待瓊脂凝固后，將平也倒置于37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出， 計(jì)算平也內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL*樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。4.2.3稀釋水樣檢測(cè)平板的菌落計(jì)數(shù)方法。4.2.3.1平板菌落數(shù)的選擇：選取

9、菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用 兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)， 則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌 落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布乂很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。4.2.3.2稀釋度的選擇：4.2.3.2.1若只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間，貝U以該 稀釋度乘以該稀釋倍數(shù)（表1例1）。4.2.3.2.2若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則 視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2,應(yīng)取其平均數(shù)；若比值大于2,則取 其中較小的數(shù)

10、字（表l例2、例3）。4.2.3.2. 3若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應(yīng)取稀釋倍數(shù) 最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（表l例4）。4.2.3.2 . 4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù) 最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例5）。4.2.3.2.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，貝U以最 接近5 / 830或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表l例6）。表1計(jì)算菌落總數(shù)方法舉例6 / 8列次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/(cfu/mL )備注10-110-210-31136516420-16400 或1.64 X 104兩

11、位以后的數(shù)字采取四舍五入的方法22760295461.637750 或3.8 X 10432890271602.227100 或_ _ 42.7 X 104無(wú)法計(jì)數(shù)1650513-513000 或5.1 X 105527115-270 或2.7 X 1026無(wú)法計(jì)數(shù)30512-30500 或一，一43.1 X 104.3多管發(fā)酵法測(cè)定水中總大腸菌群4.3.1自來(lái)水樣的檢測(cè)4.3.1.1初步發(fā)酵試驗(yàn)：在2個(gè)各裝有50mL的3倍濃縮乳糖蛋白豚培養(yǎng)液的三角瓶中（內(nèi)有倒置杜氏 小管），以無(wú)菌操作各加水樣100mL在10支裝有5mL的3倍濃縮乳糖蛋白豚培 養(yǎng)液的發(fā)酵試管中 （內(nèi)有倒置小管） ，以無(wú)菌操作

12、各加入水樣10mL搖勻后， 37C培養(yǎng)24h,24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)48h。4.3.1.2平板分離：將經(jīng)24h培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48h培養(yǎng)后產(chǎn)氣產(chǎn)酸的發(fā)酵管（瓶）,分別劃線接 種丁伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EM昕養(yǎng)基）上，37C培養(yǎng)18-24h。將符合下列特征菌落：呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屆光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深； 挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。7 / 84.3.1.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn):8 / 8將上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的典型菌落的剩余部分接丁乳糖蛋白豚發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落1 3個(gè)，37C培養(yǎng)24h,如果產(chǎn)酸乂產(chǎn)

13、氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。證實(shí)存在 后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查表2,即得總大腸菌群。表2總大腸菌群檢索表100ml陽(yáng)10ml性陽(yáng)管管012備注每升水樣中總大腸菌群數(shù)0V 3411接種水樣總量 300m（100 mL2 份，10mL10 份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069 2304.3.2奶茶、池塘水等的檢測(cè)4.3.2.1將奶茶水樣稀釋成10-1、10-2,接種水樣總量11.11ml,其中10, 0.1,0.01ml各一份， 池塘水稀釋成10-2、10-3、10-4，接種水樣

14、總量1.111ml,其中1,0.1 ,0.01,0.001ml各一份。4.3.2.2分別吸取1ml各稀釋度的水樣和1ml原水樣，各注入裝有10ml乳糖蛋白豚發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml3倍濃度乳糖蛋白發(fā)酵液的試管（瓶）中?；靹蚝?，37C培養(yǎng)24h, 24h未產(chǎn)氣繼 續(xù)培養(yǎng)至48ho9 / 84.3.2.3以下步驟與上述自來(lái)水檢測(cè)的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)相同。證實(shí)有大腸菌群存在后，將奶茶水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表3,將池塘水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表4。表3總大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1010.10.01-V 90接種水樣總量為11.11 （10, 1,0.1 , 0.01 mL 各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220