設(shè)計(jì)引物如何設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)

1、經(jīng)常有戰(zhàn)友對一些常見問題在丁香園反復(fù)問答了很多遍，所以希望園子中一些戰(zhàn) 友，特別是低分與 0 分戰(zhàn)友，能將好的帖子歸納總結(jié)了一下，并結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn) 整理，一方面這是個(gè)學(xué)習(xí)提高的過程，另一方面也能幫助大家解決這方面的問題。 同時(shí)如有不當(dāng)或不完善的地方，希望各位戰(zhàn)友不斷補(bǔ)充，爭取有朝一日我們能把 園子里戰(zhàn)友的經(jīng)驗(yàn)系統(tǒng)整理，給大家以幫助。我先把設(shè)計(jì)引物如何設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)這方面的帖子整理一下， 因?yàn)樽蛱煲幌伦涌吹?三個(gè)相似問題。原帖如下：我想向你求教一個(gè)問題 ，假設(shè)說我想把胰島素基因和 腺病蠹載體連接起來， 如何確定設(shè)計(jì)目的基因 PCR 時(shí)的引物呢？和相應(yīng)的限制性 核酸內(nèi)切酶呢？謝謝老師能給予講解,謝謝

2、整理:最初的時(shí)候，由于害怕設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)最后切不開， 所以經(jīng)常采用最通用 的方法，用 T 載體克隆解決問題，但后來發(fā)現(xiàn)她也有問題，就是濃度提不上去， 你需要體大量的載體來酶切，所以感到還是直接擴(kuò)增好一點(diǎn)。但這就需要你仔細(xì) 設(shè)計(jì)引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進(jìn)行酶切和連接，當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進(jìn)行 PCRT 增出靶基因的時(shí)候在核酸的兩端接入酶切位點(diǎn)， 酶切位點(diǎn)是 與你的質(zhì)粒的特點(diǎn)相關(guān)的，可以在質(zhì)粒的圖譜說明書上找取相應(yīng)的位點(diǎn)，進(jìn)行設(shè)計(jì)。一 設(shè)計(jì)引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個(gè)局部對片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶

3、的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用二 設(shè)計(jì)引物所要考慮的問題兩個(gè)位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，往 往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩 個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)。我看 promega 的說明書上說，最好隔四個(gè)。還有一種情 況是：不能有堿基的交義，比方 AGATCTTAA 龐樣的位點(diǎn)比擬難切。兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶切下來的殘基不要互補(bǔ)，否那么效果相當(dāng)于單酶 切。最好使用酶切效率高的。最好使用雙酶切有共同 buffer 的酶。最好使用較常用的酶如 hind3 , bamh ecorl 等，最好使用自己實(shí)驗(yàn)室有的 酶，這樣可以省錢。Tm

4、的計(jì)算，關(guān)于 Tm 的問題，很多的戰(zhàn)友都有疑惑。其實(shí)園子里有很多的解釋了。 Tm叫溶解溫度melting temperature, Tm ，即是 DNA 雙鏈溶解所需的溫度。 大家可以理解，這個(gè)溫度是由互補(bǔ)的DNA 區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?DNA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的 Tm 只有和棋板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?Tm 才有 奉獻(xiàn)。計(jì)算 Tm 時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域除非你的酶切位點(diǎn)也與棋板互補(bǔ)。不少 戰(zhàn)友設(shè)計(jì)的引物都 Tm 過低，是因?yàn)樗麄冋`把保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)都計(jì)算到Tm里了，最后的結(jié)果是導(dǎo)致了 PCR5 應(yīng)的諸多困難。所以，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不 管 5端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的 Tm 控制

5、在 55 度以上我喜歡控制在 58 以上， 具體根據(jù)PCR 勺具體情況，對于困難的 PCR 需要適當(dāng)提高 Tm,再加上酶切位 點(diǎn)和保護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。 Tm 溫度高的引物就比擬容易克服 3 發(fā)卡、二聚體及 3非特異結(jié)合等問題。簡單的 計(jì)算公式可以用 2+4 的公式。假設(shè)你計(jì)算的 Tm 值到達(dá)了快 90 ,不包括酶切位點(diǎn)。 引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為 29、33 個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別 為 17、21 個(gè)堿基。引物公司給的單子是 70 多度，實(shí)際用的只有 50 度，用

6、55 度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。其它關(guān)于 Tm 值的計(jì)算， 有用 PP5.0 進(jìn)行評價(jià)的， 需要考慮的參數(shù)包括： base numbers GC%Tm hairpin 、dimer、false priming 、cross dimer 。退一般退 火溫度為 Tm-5 度，退火溫度的計(jì)算可以不把參加的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn) 去，如上所言，PCRJL 個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以 你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你 Tm 值低些這樣可能會(huì)增加非特異性， Tm 值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的 Primer 計(jì)算出來的。1.一般在 5端加保護(hù) 堿基，如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入

7、 T-VECTO 敏者其它的載體的話，酶 切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基 2.有人的經(jīng)驗(yàn)參加酶切位點(diǎn)的引物可以和未參加時(shí)使 用相同的退火溫度，結(jié)果也還是令人滿意。關(guān)于引物二聚體，最好用 primer 或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看 引物之間的 G 自由能的絕對值，如果小于 10, 一股是問題的。如果稍大，PCRH 可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果 3端形成二聚體，并 且自由能絕對值較大，如果 PCRS 有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三 個(gè)核苜酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的G在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。 這是因?yàn)椋粋€(gè)特 異性引物一

8、般都是 20bp 左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是 28bp 左右了。而我們在設(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp)的 Tm 肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的局部序列，就可以有效地減少引 物的長度。還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的 性質(zhì)弄活楚設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在 5端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在 5 端添加 酶切位點(diǎn)，以利于 PCFT 物連接到載體。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后 5 個(gè)核苜中含有 3 個(gè) A 或 T。先用軟件設(shè)計(jì)出適宜的引物，引物的 3端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與棋板準(zhǔn)確配對，應(yīng)盡量防止在引 物 3

9、端的第一位堿基是 A。(容易錯(cuò)配)引物 3端最正確堿基的選擇是 G 和 C, 因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配比照擬穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序歹 0,如限制位 點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以參加到引物 5端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物 Tm 值時(shí)并 不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。酶切位點(diǎn)都需要保護(hù)堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點(diǎn)前加保護(hù)堿基1 ,兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上 3 個(gè)堿基，在做載體構(gòu)建的時(shí)候設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段進(jìn)行定向 連接，除了酶切位點(diǎn)，還要在兩端加一個(gè)三個(gè)核苜酸的保護(hù)序列，否那么 PCFT 物很難被酶切，因此就會(huì)導(dǎo)致連接失敗，因?yàn)閮?nèi)切酶需要一定的輔助性堿基才能順 利切割，在

10、沒有輔助堿基的情況下，有的酶是可以切割的，比方： Sall 和 SpeI, 他們不需要輔助性堿基即可切割，但大局部酶是需要輔助性堿基的。所以引物順 序應(yīng)是：5一保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對區(qū)一 3下面是幾個(gè)戰(zhàn)友的討論，請問：在引物的 5 端加限制酶切位點(diǎn)，只在酶切位點(diǎn) 的 5 端加保護(hù)堿基可以嗎？還是必須要在酶切位點(diǎn)的兩側(cè)加保護(hù)堿基？是的，只要在 5 端加保護(hù)堿基可以了。其實(shí)保護(hù)堿基就是要給限制性內(nèi)切酶一 個(gè)結(jié)合位點(diǎn),3 端還有更長的引物序列在，當(dāng)然不需要再加保護(hù)堿基了，下面就來討論一下這個(gè)問題：下面引自 NEER站1、寡核苜酸近末端位點(diǎn)的酶切為了解不同內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要

11、求，NEB 采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苜酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這里用的是寡核苜酸！ ！而不是末端帶酶切位點(diǎn)的肽鏈！實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助比 如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)，或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近 DNAC 端時(shí)也很有用。 然后 NEB 就提供了一個(gè)表，關(guān)于鏈長和切割效率的。我覺得這只能說明酶在作用 于識別位點(diǎn)時(shí)所需占據(jù)的鏈長，并不能說明在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加那么長的保護(hù) 堿基，比方我用的NotI ,要加 10 個(gè)堿基，切 25 個(gè)小時(shí)才 95%的效率，這還是 用了 20 倍的酶量！我?guī)浗阒患恿?4 個(gè)堿基，也沒見出現(xiàn)問題。2、線性載體近末端位點(diǎn)的酶切將線性載體與相應(yīng)內(nèi)切酶10

12、units/ g在適宜溫度及緩沖液條件下反響 60 分鐘，隨后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。切割效率=100%-酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù)/再連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化子數(shù)近末端堿基對數(shù)指的是從識別位點(diǎn)到 DN 林端的堿基對數(shù)，但并不包 括最初切割位點(diǎn)處留下的單鏈突出堿基。解釋一下：就像下面這個(gè)例子 EcoRI 酶切位點(diǎn)NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端堿基對數(shù)就是 3,而不是 4還沒有證據(jù)說明單鏈核苜酸能否提高切割效率，因此在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)應(yīng)至少加 上 4個(gè)額外堿基。Not I 7 100 Bluescript SK- Spe I4 100 1 Bluescript SK-Ksp I1 98 2 Blues

13、cript SK Xba I拿 NotI 為例，我覺得 NEB 合出的這個(gè)表的意思是，用 Spe I 切 Bluescript SK 載體，得到帶 7 個(gè)近末端堿基對的 NotI 酶切位點(diǎn)，切 1 小時(shí)，效率是 100%, 以次類推。也就是說只有帶 4 個(gè)末端堿基就能到達(dá) 100%的效率，而不是像 1 所 說的要加 10 個(gè)堿基，切25 個(gè)小時(shí)。因?yàn)槟鞘轻槍押塑偎岬?。這是我的理解，歡送大家討論。因?yàn)槲野l(fā)現(xiàn)很多人都是依據(jù)那個(gè)表來加保護(hù)堿基， 不管是求助還是應(yīng)助別人。然后在 5 端直接加上所需的限制性酶切位點(diǎn)而無需 考慮引入的位點(diǎn)和模板的互補(bǔ)配對情況另外保護(hù)堿基是不是也不需要與模板對 應(yīng)位置配對

14、以前討論過這個(gè)問題，其實(shí)保護(hù)堿基的問題可以歸納為幾條：1大多數(shù)常用酶，根據(jù) NE 歐司切割線性化的雙鏈 DNAt 段的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)添加，2某些比擬常用的酶，根據(jù) NE 財(cái)司雙酶先后切割的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解決，參考的文 件是 NE弦司提供的，見附件3 有些人隨意添加 3-6 個(gè)堿基，也是一種做法，我不太贊同，畢竟不同的酶對 保護(hù)堿基的要求差異很大4最通用的方法，用 T 載體克隆解決問題1。由丁內(nèi)切酶在識別位點(diǎn)時(shí)要求位點(diǎn)的兩側(cè)都有幾個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候， 要在位點(diǎn)的外側(cè)至少再加幾個(gè)堿基？比方 3 個(gè)堿基一酶切位點(diǎn)一引物。2。進(jìn)行 PCR 寸，是不是要先在較低的溫度下反響幾個(gè)循環(huán)，就是以不含酶切位 點(diǎn)時(shí)引物的

15、 Tnv 10 度，然后再在較高溫度做，把引物、酶切位點(diǎn)、額外參加的 堿基都包括在內(nèi)，得到的 T 葉 10 度。退火溫度通常都是不考慮參加的酶切位點(diǎn) 及保護(hù)堿基的，但要考慮發(fā)卡結(jié)構(gòu)，及錯(cuò)誤引發(fā)率之類的這一段時(shí)間為了換載體，重新設(shè)計(jì)引物花了不少工夫，學(xué)了不少東西，希望能和 你共勉：1.上下游引物前端個(gè)加一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)， 加保護(hù)堿基并不是你所說的“內(nèi)切酶在識別位點(diǎn)時(shí)要求位點(diǎn)的兩側(cè)都有幾個(gè)堿基，只要求在引物 5端加 保護(hù)堿基；如你需要在上游引物上加 BamHI 5-GAAGCC-3 酶切位點(diǎn)，那么你 的保護(hù)堿基可以為 C、CG 或 CGC 選擇哪一個(gè)根據(jù)你的需要，是否影響Primer的 T

16、m 值。關(guān)丁保護(hù)堿基的問題，你可以查 new England 的相關(guān)資料。Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes 10 units/ p gfor 60 minutes at the recommended incubation temperatur e andNEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavageefficiencies were determined by dividing the number of

17、transformants from thedigestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA(typically 100-500 colonies) and subtracting from 100%. Base Pairs from Endrefers to the number of double-stranded base pairs between the recognition siteand the terminus of the fragment; this number

18、 does not include thesingle-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstratedwhether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency,4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers.Average efficiencies were rounded to the neare

19、st whole number; experimentalvariation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to thenumber of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren,C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59).Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on eith

20、erside of their recognition site to cleave efficiently.EnzymeBase pairsfrom End%CleavageEfficiencyVectorInitial CutAat II388 (2)LITMUS 29Nco I2100 (2)LITMUS 28Nco I195LITMUS 29PinA IAcc65 I299 (2)LITMUS 29Spe I175pNEB193Sac IAfl II113 (2)LITMUS 29Stu IAge I1100 (1)LITMUS 29Xba I1100 (2)LITMUS 29Aat

21、IIApa I2100 (1)LITMUS 38Spe IAsc I197pNEB193BamH IAvr II1100 (2)LITMUS 29Sac IBamH I197LITMUS 29Hind IIIBgl II3100 (2)LITMUS 29Nsi IBsiW I2100 (2)LITMUS 29BssH IIBspE I2100 (1)LITMUS 39BsrG I18 (2)LITMUS 38BsrG IBsrG I299 (2)LITMUS 39Sph I188 (2)LITMUS 38BspE IBssH II2100 (2)LITMUS 29BsiW IEag I2100

22、 (2)LITMUS 39Nhe IEcoR I1100 (1)LITMUS 29Xho I188 (1)LITMUS 29Pst I1100 (1)LITMUS 39Nhe IEcoR V1100 (2)LITMUS 29Pst IHind III390 (2)LITMUS 29Nco I291 (2)LITMUS 28Nco I10 (2)LITMUS 29BamH IKas I297LITMUS 38NgoM IV193 (1)LITMUS 38Hind IIIKpn I2100 (2)LITMUS 29Spe I2100 (2)LITMUS 29Sac I199 (2)pNEB193S

23、ac IMlu I299 (2)LITMUS 39Eag IMun I2100 (1)LITMUS 39NgoM IVNco I2100 (1)LITMUS 28Hind IIINgoM IV2100 (1)LITMUS 39Mun INhe I1100 (1)LITMUS 39EcoR I282 (1)LITMUS 39Eag INot I7100 (2)Bluescript SK-Spe I4100 (1)Bluescript SK-Ksp I198 (2)Bluescript SK-Xba INsi I3100 (2)LITMUS 29BssH II377LITMUS 29Bgl II2

24、95LITMUS 28BssH IIPac I176pNEB193BamH IPme I194pNEB193Pst IPst I398 (1)LITMUS 29EcoR V250 (5)LITMUS 39Hind III137LITMUS 29EcoR ISac I199 (2)LITMUS 29Avr IISal I389 (2)LITMUS 39Spe I223 (2)LITMUS 39Sph I161 (3)LITMUS 38Sph ISpe I2100 (2)LITMUS 29Acc65 I2100 (2)LITMUS 29Kpn ISph I299 (1)LITMUS 39Sal I

25、297LITMUS 39BsrG I192 (2)LITMUS 38Sal IXba I1199 (2)94 (1)LITMUS 29LITMUS 29Age IPinA IXho I197LITMUS 29EcoR IXma I2298 (1)92 (1)pNEB193pNEB193Asc IBssH II寡核苜酸近末端位點(diǎn)的酶切為了解不同內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，N E B * 用 了 一 系 列含識別序列的短雙鏈寡核苜酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對丁確定雙酶切 順序?qū)?huì)有幫助比方在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)，或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近 DNA 末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出

26、的酶，那么通常需在識別位點(diǎn)兩端至少加上6個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶切反響的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用Y-32PATP 在 T4 多聚核苜酸激酶的作用下標(biāo)記 0.1A260單位的寡 核苜酸。取 1pg已標(biāo)記了的寡核苜酸與 20 單位的內(nèi)切酶，在 20。C條件下分別 反響 2 小時(shí)和 20小時(shí)。反響緩沖液含 70 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2,5 mMDTT 及適量的 NaCl 或 KCl 視酶的具體要求而定。20%J PAGE 7 M 尿素 凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切白分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苜酸作 為對照。假設(shè)底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率那么可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)

27、構(gòu)而降低iW寡核苜酸序列切割率%2 hr20 hr1Acc IGGTCGAC C800CG3TCGAC CG1000CCGTCGACGG1200Afl IIICACATGT800CCXCATGCKG109090CCCACATGTGG129090rAsc IGGCGCGCC89090AGGCGCGCC109090TTGGCGCGCC129090Ava ICCCCGGG85090CGCCCGG3E109090TCCXCGCGGGGA129090廠BamH ICGGATCC81025CG3GATCC CG109090CGGGATG3CG129090Bgl IICAGATCT800GAAGATCT T

28、C107590GGA AGATCT TCC122590BssH IIGGCGCGC800AGGCGCGCT1000TTGGCGC(CAA125090BstE IIG3GT(A/T)AC(C C9010BstX IAACTGCAGACAATGCATTGG2200AAAACTGCAGAATGCATTGG242550CTGCAGACAATGCATTGG GCAT272590Cla ICATCGAT800GATCGAT800CCXTCGATG109090CCCATCGATGG125050EcoR IGGAATTC C89090CG3AATTC CG109090CCGAATTC CGG129090I-H

29、ae IIIGCEGCC CC89090AG(GGCGCT109090TTG(GGCGCAA129090Hind IIICAAGCTT800CCXAGCTTG1000CCCAAGCTTGG121075Kpn IG3GTAGC C800GG3GTACC CC109090CGG GGTACCCG129090Mlu IGACGCGT800CGKCGCG1G102550Nco ICCCATGG G800CATCATGCATG145075Nde ICCATATG800CCCATATGG1000CGCATATG GCG1200GGGTTTATATAAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC207590GGGAATCATATG GAATTCCC227590Nhe IGGCTAGC C800CG3CTAGC CG101025CTAGCTAGTAG121050Not ITTGCGGCCGC1200AIIIGCGGCCIGCA161010AAATAGCGGCCGCTAAA201010ATAAGAATCGGCCGAACTAT242590廠AAGGAAAAAAGGCCAAAAGGAAAA282590Nsi ITG(ATGCATCA121090CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22909