臨床微生物試驗室細菌鑒定指引設(shè)計上0001

1、臨床微生物實驗室細菌鑒定指南上錄入時間:2010-11-22 10:40:51來源：某某醫(yī)學院附屬醫(yī)院.細菌的鑒定步驟1 .鑒定的概念：將一個未知的菌株按其生物學特性，經(jīng)過與所有菌種進展比擬后 劃歸到一個菌種的分析過程。2 .對待鑒定的菌種要明確已經(jīng)獲得純化培養(yǎng)或者該菌種在血平板上生長良好，有 單個菌落可以進展生化試驗。我們這里一般都是預先純化培養(yǎng)3 .對待鑒定的菌種進展革蘭染色，觀察形態(tài)G+c, G b, G c, G+b，做觸酶， 氧化酶實驗，然后按科，屬，種逐步鑒定。要注意對待鑒定的菌種選擇一個適宜 的鑒定系統(tǒng)，臨床常見細菌的快速簡單的鑒定系統(tǒng)我們都已經(jīng)設(shè)計好，參考鑒定質(zhì)控單。4 .按鑒

2、定質(zhì)控單的要求填寫好病人某某，年齡，性別；標本類型，標本編號，送 檢日期等。另外最重要的是要填寫好該菌種的菌落形態(tài)以與有無溶血。5 .復習革蘭染色，觸酶實驗，氧化酶實驗。.革蘭染色：是細菌鑒定過程中最常用最根本最重要的染色方法。首先要將待鑒定的細菌涂片，固定目的：殺死細菌，改變細菌對染料的通透性C第一步：以結(jié)晶紫初染染色液I第二步：以盧戈氏碘液媒染染色液H第三步：用95%乙醇脫色染色液田第四步：最后用稀釋復紅復染染色液IV.觸酶實驗（H2O2實驗）：a原理：具有過氧化氫酶的細菌能催化雙氧水生成水和初生態(tài)氧，繼而形成 氧分子出現(xiàn)氣泡。b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在潔凈的玻片上涂開，滴加3

3、%過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果立即有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。 要注意不能在血平板上進展實驗， 這樣易出現(xiàn)假陽性；另外陳舊菌落要是進展實 驗可能會導致假陰性結(jié)果；還有不能在接種針或環(huán)上進展實驗。c.陽性對照用金黃色葡萄球菌，陰性對照用鏈球菌；試劑要避光置4c冰箱保存。d.應(yīng)用：絕大多數(shù)含細胞色素的需氧和兼性厭氧細菌觸酶實驗陽性，鏈球菌 屬陰性。臨床常見細菌鑒定實驗中我們一般用于區(qū)別葡萄球菌屬+，微球菌屬+，鏈球菌屬一。.氧化酶實驗Kovac實驗：a. 原理：氧化酶又稱細胞色素酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。酶并不 直接與試劑1%鹽酸四甲基對苯二胺起反響，而是首先使細胞色素c氧化

4、，然后氧化型細胞色素c使對苯二胺氧化，出現(xiàn)深蘭色反響。b. 方法濾紙法，菌落法，試劑紙片法：一般我們采用濾紙法，取白色潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽性者立即呈粉紅色，繼而出現(xiàn)深蘭色。結(jié)果讀取在 10秒鐘時為最優(yōu)，60秒內(nèi)讀取可 靠。本實驗防止接觸含鐵物質(zhì)假陽性，也不能在含糖培養(yǎng)基上生長的菌落進 展實驗假陰性。c. 陽性對照用銅綠假單胞菌，陰性對照用大腸埃希菌。d. 應(yīng)用：奈瑟氏屬的菌種均陽性，也用于區(qū)別假單胞菌屬和腸桿菌，前者陽性， 后者陰性。二.葡萄球菌屬的鑒定葡萄球菌屬主要的種有金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。1 . pm,菌體圓形，呈單個，成雙以與不規(guī)簇狀排列。染色

5、呈紫色，為革蘭陽性球 菌。2 .與鏈球菌的區(qū)別：觸酶實驗為陽性，而鏈球菌陰性；菌體形態(tài)鏈球菌小于葡萄 球菌，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形的革蘭陽性球菌。3 .與微球菌的區(qū)別：觸酶實驗同為陽性，但微球菌的菌體呈四聯(lián)狀，要大于葡萄 球菌，微球菌葡萄糖氧化發(fā)酵實驗操作方法同甘露醇OF試驗為氧化型；而葡萄球菌為發(fā)酵型。另外吠喃哇酮即痢特靈50仙g/片敏感實驗微球菌為耐藥， 而金黃色葡萄球菌為敏感。4 .葡萄球菌屬的種間鑒定：.菌落色素與溶血毒素：金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色，檸檬色或者淡黃 色，而其他葡萄球菌如此在血平板上菌落大多數(shù)為白色，也有局部為檸檬色或深黃色。.溶血毒素：金黃色葡萄球菌有a、B、

6、丫、6溶血毒素，各毒素的區(qū)別是對動 物紅細胞的溶血X圍、抗原性與溶血時的溫度等。其中以a溶血毒素為主。而 其他葡萄球菌大多數(shù)不產(chǎn)生溶血毒素，只有表葡有極少能產(chǎn)生溶血毒素。.血漿凝固酶實驗：用與區(qū)別金黃色葡萄球菌陽性，表皮葡萄球菌陰性， 腐生葡萄球菌陰性。血漿凝固酶是金葡菌所產(chǎn)生的，有結(jié)合凝固酶和游離凝 固酶兩種。血漿凝固酶檢測有兩種方法，為玻片法和試管法，我們一般采用玻片法。a.操作方法：挑取少許金黃色葡萄球菌菌落在玻片上與血漿乳化， 結(jié)合凝固酶能 作用于血漿中的纖維蛋白原，從而在金黃色葡萄球菌外表發(fā)生凝集， 所以我們?nèi)?眼能看見凝集顆粒。玻片法主要由結(jié)合凝固酶作用產(chǎn)生；游離凝固酶是金黃色葡

7、萄球菌產(chǎn)生的胞外酶，能與血漿中的血漿凝固反響因子類似凝血酶的一種物質(zhì) 作用，形成復合物再使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白而發(fā)生凝集。 試管法主要由游 離凝固酶作用產(chǎn)生。b.須知事項：菌落不能太多，否如此會影響結(jié)果觀察；凝固酶陽性要做自凝陰 性對照用生理鹽水代替血漿，只有在陰性對照也不凝集才能認為是真正的陽 性，有一局部葡萄球菌有自凝現(xiàn)象。.新生霉素敏感實驗：金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌對新生霉素紙片5pg/片敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌如此對之耐藥。抑菌環(huán)直徑>16mm即為新生霉素敏感。.甘露醇氧化發(fā)酵實驗：a.操作方法：取兩支甘露醇微量生化管，在微量管內(nèi)接種待檢細菌，然后一支加 兩滴石臘密封

8、，另外一支如此不加，放 37c孵箱內(nèi)1824h后觀察結(jié)果。b.結(jié)果觀察：微量生化管變黃色為陽性，也就是能利用甘露醇。假如兩管都變黃 色如此說明是發(fā)酵型；其中加石蠟管不變色，沒加石蠟管變黃色如此為氧化型； 如果兩管都不變色如此說明該細菌是不利用甘露醇產(chǎn)堿型。c.應(yīng)用：金黃色葡萄球菌在需氧和厭氧的條件下都能利用甘露醇即兩管都變黃 色；表皮葡萄球菌需氧局部產(chǎn)酸，厭氧條件下不利用甘露醇即沒加石蠟管有 局部會變黃色，加石蠟管不變黃色；腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌類似。三.微球菌屬的種間鑒定微球菌屬主要的種有易變微球菌，藤黃微球菌，玫瑰微球菌。鑒定生化見下微球菌屬的種間鑒定易變微球菌藤黃微球菌玫瑰微球菌色素

9、產(chǎn)生黃色黃色粉紅色需氧葡穩(wěn)糖產(chǎn)酸十十一硝酸鹽復原十一一月尿素酶dd十氧化酶弱一十/ +新生霉素敏感S/RSRd:不定 S:敏感 R:耐藥四.鏈球菌屬1 . m,呈成雙和鏈狀排列的卵圓形革蘭陽性球菌，菌體小于葡萄球菌，無鞭毛， 沒有芽胞，但有些菌株會形成莢膜。肺炎鏈球菌呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外。2 .根據(jù)鏈球菌在血平板上溶血現(xiàn)象的不同分為三種：甲型a-溶血，即菌落周圍出現(xiàn)較窄的草綠色溶血環(huán)；乙型B -溶血，即菌落周圍出現(xiàn)較寬的透 明溶血環(huán)；丙型丫 -溶血，即菌落周圍無溶血環(huán)。3 .根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)C多糖抗原的不同可分為A、B、C、D、E、F、G、H、K、L 、M、N、O、P、Q、R、S、T等18

10、個群，對人類有致病者 90%屬于A群，偶見其他群鏈球菌致病。4 .鏈球菌屬的種間鑒定.乙型溶血鏈球菌的鑒定：a,對桿菌肽0.04U/片抑菌圈直徑10mm敏感：A群鏈球菌主要為化膿 性鏈球菌。b.對桿菌肽不敏感，膽汁七葉甘實驗陰性，但馬尿酸鈉水解實驗、CAMP實驗陽性：B群鏈球菌主要為無乳鏈球菌。c,對桿菌肽不敏感，膽汁七葉甘實驗陰性，馬尿酸鈉水解實驗陰性，CAMP實驗陰性：主要為馬鏈球菌、類馬鏈球菌、獸疫鏈球菌； 對三者的區(qū)別實驗要加做海 藻糖和山梨醇實驗。d. CAMP實驗：將能產(chǎn)生B -溶血的金黃色葡萄球菌在血平板上劃一橫線接種，再 將待鑒定菌于金黃色葡萄球菌 3mm處垂直種一短線，假如在

11、有 CO2條件下培養(yǎng) 56小時，或無CO2條件下培養(yǎng)1824小時，在兩細菌連接處出現(xiàn)一個半月型 的加強溶血區(qū)即為CAMP實驗陽性。.甲型溶血鏈球菌的鑒定：a.草綠色鏈球菌：對桿菌肽敏感，對奧普托欣Optochin不敏感，膽汁溶菌實驗 陰性，膽汁七葉甘實驗陰性，在高鹽中不生長。主要有變異鏈球菌，輕型鏈球菌, 血鏈球菌，唾液鏈球菌等。b.肺炎鏈球菌：菌體呈矛頭狀，成雙排列，鈍端相對，尖端相背，較葡萄球菌， 其他鏈球菌略大；在血平板上菌落細小、圓形、外表光滑、灰白色、半透明， 開 始時菌落呈扁平狀，以后中心塌陷，呈臍窩狀。與草綠色鏈球菌的主要區(qū)別是膽 汁溶菌實驗陽性，對奧普托欣Optochin敏感。

12、奧普托欣Optochin含量為 5 pg/片，抑菌環(huán)18mm為敏感，15mm為不敏感，1518mm應(yīng)重復實驗。.腸球菌D群鏈球菌的鑒定：溶血不定，主要是a -、丫-溶血；對桿菌肽不敏感，但其特異性實驗是膽汁七葉 昔實驗陽性；假如能在6.5%NaCl的心浸液肉湯中生長即為 D群腸球菌，不能生 長為D群非腸球菌。.鏈球菌屬鑒定的系統(tǒng)生化結(jié)果判斷a. 1%美蘭牛乳b.膽汁七葉甘實驗：變黑為陽性。c. PH9.6肉湯實驗：變渾濁為能在堿性環(huán)境中生長陽性。d. 6.5%NaCl心浸液肉湯：由紫變黃為能在高鹽環(huán)境中生長陽性。e.精氨酸雙水解酶實驗：變紅色對照不變色，仍為黃色為陽性。臨床微生物實驗室細菌鑒定

13、指南下錄入時間:2010-11-22 10:44:19來源：某某醫(yī)學院附屬醫(yī)院五.奈瑟氏菌屬和布蘭漢菌屬奈瑟氏菌屬主要有腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布蘭漢氏菌屬只有卡他布蘭 漢氏菌。兩者系需氧革蘭陰性球菌。 奈瑟氏菌的生物學特性：革蘭陰性球菌，需氧，卵圓形或腎形，無動力，氧化 酶與觸酶均陽性。培養(yǎng)時對營養(yǎng)要求高，能在巧克力平板或有豐富營養(yǎng)的血平板 上，在510%CO2環(huán)境中生長。.鑒定過程：a. DNA酶實驗陽性為布蘭漢氏菌，陰性如此為奈瑟氏菌。b.能在普通血平板上生長的為其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生長的主要為腦膜 炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c.能使麥芽糖氧化分解產(chǎn)酸的是腦膜炎奈瑟氏菌，不

14、利用麥芽糖的是淋病奈瑟氏 菌。.幾種主要細菌對葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的氧化分解產(chǎn)酸結(jié)果如下：氧化分解產(chǎn)酸葡錮糖麥芽糖淋病奈瑟氏菌十一一腦膜炎余瑟氏菌十十一粘液奈瑟氏菌+十卡他布蘭漢菌一一一 DNA酶實驗：a.方法：將待鑒定細菌點種于含0.2%DNA的DNA瓊脂平板上，培養(yǎng)后用 1mmol/LHCl覆蓋平板，菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)者為陽性。b.原理：某些細菌能產(chǎn)生DNA酶，可使DNA長鏈水解成由幾個單核甘酸組成的 寡核甘酸鏈；長鏈DNA可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核甘酸鏈如此可溶于 酸，故在DNA瓊脂平板加鹽酸，可在菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。腸桿菌科 中只有沙雷氏菌和變形桿菌可產(chǎn)生 DNA酶，陽性球

15、菌中只有金葡菌能產(chǎn)生 DNA酶。六.腸桿菌科腸桿菌科是一大群生物學性狀相似的革蘭陰性桿菌，其中對人致病性較強 的鼠疫耶爾森菌現(xiàn)已根本沒有流行和傷寒沙門菌；4類常引起腹瀉和腸道感染的細菌埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌和8種常導致院內(nèi)感染的細菌枸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、多源菌屬、沙雷菌屬、變形 桿菌屬、普羅威登菌屬和摩根菌屬o另外還有很多細菌是腸道的正常菌群， 但 在一定條件下也可致病條件致病菌。實驗過程中對于革蘭陰性桿菌首先要做氧化酶實驗， 陰性為腸桿菌科細菌； 陽性的為非發(fā)酵菌我們實驗室還沒有簡單的系統(tǒng)鑒定方法， 一般要儀器上卡檢 測或弧菌科細菌。1.腸桿菌科的系統(tǒng)生化.K

16、IA試驗克氏雙糖鐵組成：乳糖/葡萄糖=10/1斜面/高層，其長度最好是都是 2CM結(jié)果判斷：斜面或高層變黃色：陽性；不變色紅色：陰性高層中出現(xiàn)裂隙：產(chǎn)氣陽性高層中出現(xiàn)黑色FeS：產(chǎn)H2s陽性.苯丙氨酸脫竣酶試驗細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫竣酶使苯丙氨酸氧化脫竣后生成苯丙酮酸，再與10%的FeCl3試劑產(chǎn)成深綠色反響。變形桿菌屬、普羅威登菌屬和摩根菌屬為陽性， 其他為陰性枸檬酸鹽試驗碳源利用實驗在枸檬酸鹽培養(yǎng)基中細菌能利用的碳源只有枸檬酸鹽，分解后生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性，pH指示劑澳麝香草酚藍由淡綠色變?yōu)樯钐m色，即為枸檬酸鹽試驗 陽性。埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，愛德華菌屬為陰性，其他為陽性注意：接種時

17、不能被糖，蛋白陳污染，要單獨接種.甲基紅MR試驗細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等, 使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下時，參加甲基紅指示劑由桔黃色變桔紅色為弱陽 性；變紅色為陽性。培養(yǎng)基成分：葡萄糖蛋白陳水試劑：甲基紅0.1g,酒精300ml,水200ml主要用于大腸埃希菌+和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別；常與V-P實驗聯(lián)合使用, 一般情況下兩者結(jié)果正好相反，但也有例外如奇變兩者同為陽性。.MIU動力靛基質(zhì)尿素試驗 .動力：在半固體培養(yǎng)基中穿刺接種細菌培養(yǎng)后，假如穿刺線周圍有細菌擴散生 長，如此為動力+；清晰如此為動力一。 .靛基質(zhì)試驗呷深試驗：某些細菌有色氨酸酶，能分解

18、培養(yǎng)基中的色氨酸生 成呷咪。呷咪再與試劑對位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰呷珠而呈紅色。 .尿素試驗：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿， 再使培養(yǎng)基中的指示劑0.4%酚紅變紅色即為陽性。.硝酸鹽復原試驗NO3 鵬O2 -大腸NO3 NH4+NO3 -N2沙雷氏菌屬試劑甲：對氨基苯磺酸試劑乙：a -蔡胺觀察結(jié)果時甲液和乙液要等量參加， 立即或10min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性。假如不變 色，如此要參加鋅粉：變紅色，說明硝還試驗為真陰性仍不變色，說明硝還 試驗真陽性，但原先復原產(chǎn)物不是 NO2 - 0陰性結(jié)果出現(xiàn)時有三種可能：細菌不能復原硝酸鹽亞硝酸鹽繼續(xù)分解生成氨 或氮培養(yǎng)基不適合細菌

19、生長腸桿菌科細菌均能復原硝酸鹽為亞硝酸鹽。.氨基酸脫竣試驗細菌產(chǎn)生脫竣酶分解氨基酸使其脫竣生成胺和 CO2,雖然各種細菌所產(chǎn)生的脫竣酶不 一定一樣，但最后都能生成胺賴氨酸一尸胺，鳥氨酸一腐胺，精氨酸一精胺 和CO2。然后胺能使培養(yǎng)基變堿性，通過指示劑澳甲酚紫由黃變紫即為陽性。 對照管無氨基酸為黃色。注意：微量管接種好后要加石蠟，使培養(yǎng)基造成厭氧環(huán)境。生成的胺更穩(wěn)定，還 能誘導氨基酸脫竣酶的產(chǎn)生對照管如果不顯黃色，如此結(jié)果不能判斷。用：除傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌外，其他沙門氏菌鳥AA,賴AA均為陽性；除宋氏和鮑氏志賀菌外其他志賀菌也菌為陽性。葡萄糖酸鹽試驗微量管在培養(yǎng)1824h后，加班氏試劑，水

20、浴煮沸10min,由蘭色變黃綠色到磚紅色 即為陽性，不變?yōu)殛幮浴? .腸桿菌的鑒定流程(1) .根據(jù)苯丙氨酸脫竣酶實驗：+：變形桿菌屬，普羅威登斯菌屬，摩根氏菌屬：埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，沙門氏菌屬，枸檬酸桿菌屬，愛德華菌屬；克雷伯 菌屬，腸桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬。.苯丙氨酸脫竣酶實驗陰性，加做葡萄糖酸鹽實驗+：克雷伯菌屬，腸桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬a.動力一：克雷伯菌屬，屬內(nèi)種的鑒定主要根據(jù)呷咪試驗肺克呷深實驗陰 性，二個亞種鑒別試驗IMViC :肺炎1,臭鼻I d,鼻硬結(jié)Ib.動力+，DNA酶+：沙雷氏菌屬動力+，DNA酶，枸檬酸鹽+：腸桿菌屬主要是陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌

21、，前者賴氨酸陰性，而后中為陽性動力+，DNA酶一，枸檬酸鹽一：哈夫尼亞菌屬：加做IMViC靛基質(zhì)-甲基紅-VP-枸檬酸鹽試驗a. IMViC + + ：大腸埃希菌H2S-或愛德華菌屬H2S+。b. IMViC一/ + + +：枸檬酸桿菌屬.苯丙氨酸脫竣酶實驗陽性，根據(jù)產(chǎn) H2s可分+：變形桿菌屬屬內(nèi)主要鑒定試驗如下普艾奇變產(chǎn)粘變潘尼氏尿素酶十十十十鳥氨酸一十一一靛基質(zhì)十一一一麥芽糖一一十十木糖十十一十一：普羅威登氏菌屬，摩根氏菌屬普羅威登氏菌屬：鳥氨酸：-；枸檬酸鹽：+屬內(nèi)鑒定尿素酶與一些碳水化合物 的產(chǎn)酸試驗，如甘露醇、阿拉伯糖、海藻糖等摩根氏菌屬：鳥氨酸：+;枸檬酸鹽：只有一個種：摩氏摩根

22、氏菌.志賀氏菌屬和沙門氏菌屬這兩種菌屬在腸道選擇性培養(yǎng)基SS、麥康凱形成不發(fā)酵乳糖的透明或半 透明的無色菌落，但一些沙門氏能產(chǎn)H2s就會形成中心黑色的菌落，鑒定時在選 擇性培養(yǎng)基上挑選可疑菌落進展鑒定。a.志賀氏菌屬主要系統(tǒng)生化：KIA : K/A只有福氏6型能產(chǎn)氣，H2s； MIU : -+/-苯丙：；枸檬酸鹽：。報告結(jié)果時要根據(jù)其血清學的結(jié)果鑒定到種，即 A群痢疾志賀氏菌、B群 福氏志賀氏菌、C群鮑氏志賀氏菌、D群宋氏志賀氏菌；我國主要以B群和D群為主。b.沙門氏菌屬主要系統(tǒng)生化：KIA : K/AG , H2s+/一； MIU:苯丙：；枸檬酸鹽: 一O傷寒沙門氏菌的抗原結(jié)構(gòu)：菌體抗原O抗原，鞭毛抗原H抗原，包膜抗 原主要是Vi抗原根據(jù)系統(tǒng)生化鑒定到沙門氏菌屬后，在根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)的特點，用血清學凝集分 到種即可報告結(jié)果。血清凝集步驟如下：A-F 多價 O 十：O2, Ha +： A群甲型副傷寒沙門氏菌O4, Hb +： B群乙型副傷寒沙門氏菌O6 7, Hc, Vi +： C群內(nèi)型副傷寒沙門氏菌O9, Hd, Vi +： D群傷寒沙門氏菌。3、10, Heh 十： E群Oi