3實驗三-DNA的瓊脂糖凝膠電泳1ppt課件

1、實驗三實驗三 DNADNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳一一 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNADNA的方法和技術(shù)。的方法和技術(shù)。 自從瓊脂糖自從瓊脂糖agaroseagarose和聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺polyacrylamidepolyacrylamide凝膠凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNADNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNADNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多

2、分子生物學(xué)研究方法，如：實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如： DNADNA分型、分型、DNADNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。二二 實驗原理實驗原理 DNA DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 核酸為兩性分子，在核酸為兩性分子，在pH3.5pH3.5時，整個分子帶正電；時，整個分子帶正電； pH8pH8左右時，整個分子帶負電。左右時，整個分子帶負電。 在堿性環(huán)境下，核酸分子

3、之糖在堿性環(huán)境下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基團是呈離子化狀態(tài)的，把這磷酸骨架中的磷酸基團是呈離子化狀態(tài)的，把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖- -磷酸骨架在結(jié)磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNADNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNADNA分子的這種遷移速度，亦即電泳分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本

4、身的大小和構(gòu)型。的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。DNADNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNADNA分子。共價閉環(huán)超螺旋分子。共價閉環(huán)超螺旋DNADNA直線直線DNADNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNADNA。 二二 實驗原理實驗原理 凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度分離分離DNADNA片段的大小范圍片段的大小范圍bpbp）0.3%瓊脂糖瓊脂糖50 0001 0000.7%瓊脂糖瓊脂糖

5、20 0001 0001.4%瓊脂糖瓊脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 DNA DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNADNA

6、的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、嵌的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。入染料的存在、電泳緩沖液的組成。瓊脂糖凝膠分辨瓊脂糖凝膠分辨DNADNA片段的范圍為片段的范圍為0.250kb0.250kb之間之間 EB( EB(溴化乙錠溴化乙錠) ) 能插入能插入DNADNA分子堿基對之間，導(dǎo)分子堿基對之間，導(dǎo)致致EBEB與與DNADNA結(jié)合。結(jié)合。DNADNA吸收的吸收的260nm260nm的紫外光傳遞給的紫外光傳遞給EBEB，或者結(jié)合的，或者結(jié)合的EBEB本身在本身在300300和和360360吸收的射線，均吸收的射線，均可在可見光區(qū)以可在可見光區(qū)以590590波長發(fā)射出來，呈

7、橙紅色。電波長發(fā)射出來，呈橙紅色。電泳時所需泳時所需DNADNA樣品量僅樣品量僅0.50.51g.1g. EB EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng10ng或更或更少的少的DNADNA即可檢出；可以加到樣品中或膠中。即可檢出；可以加到樣品中或膠中。 EBEB是誘變劑，使用時一定要戴手套。是誘變劑，使用時一定要戴手套。 EBEB廢液廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。要經(jīng)過處理才能丟棄。 在紫外線的照射下結(jié)合溴化在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的乙錠的DNADNA分子發(fā)出熒光分

8、子發(fā)出熒光三三 實驗步驟實驗步驟 稱樣稱樣溶解溶解加熱加熱制板制板倒膠倒膠取樣取樣點樣點樣電泳電泳檢測檢測三三 實驗步驟實驗步驟 制膠制膠 1.0 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 (50ml) 凝膠板的制備凝膠板的制備 小心加入小心加入23lEB，搖勻污染，搖勻污染EB吸頭，不宜吸頭，不宜再回收使用）再回收使用） 點樣點樣 樣品樣品20l，與，與4l溴酚蘭混勻溴酚蘭混勻 ( DNA maker 3l 加入加入10l水與水與4l溴酚蘭混勻溴酚蘭混勻) 電泳電泳穩(wěn)壓穩(wěn)壓 80v，DNA向陽極移動向陽極移動, 大約大約50-60min 觀察和拍照觀察和拍照254nm紫外燈下觀察紫外燈下觀察 四四 實驗結(jié)果實驗結(jié)果 五五 本卷須知本卷須知 EBEB是一種誘變劑，操作時必須戴塑料或乳膠手套是一種誘變劑，操作時必須戴塑料或乳膠手套!六六 習(xí)習(xí) 題題 瓊脂糖凝膠電泳的適用范圍？瓊脂糖凝膠電泳的適用范圍？2.2.影響瓊脂糖凝膠電泳的因素有哪些？影響瓊脂糖凝膠電泳的因素有哪些？4 4 泳道