生物化學試題

1、 1.生物化學:（分子生物學）是研究活細胞和有機體中存在的各種化學成分及其所參與的化學反應 的一門科學，因此又是一門關于生命現(xiàn)象化學基礎的一門科學.生物化學是研究生命物質(zhì)的化學組成結(jié)構(gòu)，及生命過程中各種化學變化的生物學分支學科。 2.生物膜:主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，一般也含有糖類，其基本結(jié)構(gòu)可用流動鑲嵌模型來表示，即脂質(zhì)分子形成雙層膜，膜蛋白以不同程度與脂質(zhì)相互作用并可側(cè)向移動 3. “生物導彈”:是對單克隆抗體的一種形象化說法，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動導向，在生物體內(nèi)與特定目標細胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。 4. 單克隆抗體:

2、由單個細胞克隆產(chǎn)生的抗體叫單克隆抗體。他可以和相應抗原的單個抗原決定簇相結(jié)合。單克隆抗體在分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和特異性等方面都是一致的 5. 細胞系: 當雜交瘤細胞生長在培養(yǎng)液中，它的在遺傳上相同的后代會繼續(xù)產(chǎn)生具有B母細胞特征的抗體。在那群遺傳上相同的后代中的一個被稱為一個純種細胞系（克隆clone 6.細胞信號轉(zhuǎn)到： 研究細胞內(nèi)、細胞間信息傳遞的分子基礎。構(gòu)成生物體的每一個細胞的分裂與分化及其它各種功能的完成均依賴于外界環(huán)境所賦予的各種指示信號 7.生物大分子： 有一定分子結(jié)構(gòu)規(guī)律，即由一定的基本結(jié)構(gòu)單位，按一定的排列順序和連接方式而形成的多聚體，分子量一般大于104。 8. 兩性電離性質(zhì)

3、：在一定pH環(huán)境下，氨基酸游離成陰、陽離子的程度及趨勢相等或不游離(氨基酸不帶電荷或所帶電荷數(shù)相等)而成為兼性離子(Zwitterion)，在電場中既不向陽極也不向陰極遷移時的pH值。 9. 紫外吸收性質(zhì)：Trp、Tyr和Phe含共軛雙鍵苯環(huán)，在 280nm處有最大吸收峰，利用此特點可用分光光度法測定蛋白質(zhì) 含量也可粗略估計核酸中蛋白質(zhì)污染程度 10. 肽鍵： 一個氨基酸的-羧基與另一氨基酸的-氨基脫水縮合 肽：氨基酸通過肽鍵相連而形成的化合物 11. 寡肽(oligopeptide): 十個以下氨基酸縮合成的肽統(tǒng)稱為寡肽 12. 蛋白質(zhì): 由一條或幾條多肽鏈組成的生物大分子 13. 氨基酸殘

4、基(amino acid residues)：蛋白質(zhì)肽鏈中的每個氨基酸部分 14. 多肽主鏈（main chain）：由肽鍵連接各氨基酸殘基形成的長鏈骨架 多肽側(cè)鏈(side chain)：蛋白質(zhì)多肽鏈中的各氨基酸側(cè)鏈基團 15. 疏水鍵：非極性基團為避開水相而聚集在一起的作用力 16. 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) (構(gòu)象): 蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子圍繞某些共價鍵旋轉(zhuǎn)而形成的空間排布及相互關系。構(gòu)象決定著蛋白質(zhì)的分子形狀、理化性質(zhì)和生物學活性。 17. 二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)：蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)， -螺旋 、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲 三級結(jié)構(gòu)(tertiary

5、structure):整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，主要靠次級鍵（疏水鍵、離子鍵、氫鍵和Van der Walls力維持） 四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure):蛋白質(zhì)分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用（主要靠疏水鍵維持） 18. motif（模體或模序）：多肽鏈中一些二級結(jié)構(gòu)單元，在空間上靠近，相互作用，形成有規(guī)則的?、?、? 19. domain（結(jié)構(gòu)域）：多肽鏈上某些超二級結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系，進一步形成可明顯區(qū)分的空間結(jié)構(gòu)區(qū)域,并具有特定的生物學功能。 20.分子伴侶： 功能是幫助其他含多肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進行正確的非共價的組裝，但不是組裝完成后的

6、結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能時的組成部分 作用是防止新生肽鏈的錯誤折疊和聚集，而自身并不成為其最后結(jié)構(gòu)的一部分 21.折疊酶：在蛋白質(zhì)折疊過程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。 22. 折疊?。和蛔兊鞍字g的相互作用導致蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊，因為降解不徹底而形成不溶性沉淀。不溶性沉淀形成過多，嚴重干擾正常的神經(jīng)活動，引起失能，屬于“折疊病 23. 酶原 (zymogen)：有些酶在細胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原 酶原的激活：在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過程。 24：變構(gòu)調(diào)節(jié)： 一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從

7、而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié) 25：共價修飾 在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團可與某種化學基團發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾 26. 蛋白質(zhì)變性: 在理化因素作用下, 蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵和非共價鍵被破壞, 天然構(gòu)象發(fā)生變化, 引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和活性的改變 27. 中性鹽沉淀反應 ：稀鹽可使蛋白質(zhì)表面同性電荷增加，增加蛋白質(zhì)分子間的排斥, 同時與水分子間的作用增強, 而增加溶解性鹽溶作用；高鹽破壞水膜、中和電荷, 蛋白質(zhì)聚集沉淀鹽析, 不同蛋白質(zhì)鹽析的鹽濃度不同, 故用不同鹽濃度分級沉淀蛋白質(zhì), 分離的蛋白質(zhì)不變性 28. 有機溶劑沉淀

8、反應 ：用與水互溶的乙醇、丙酮等奪取水膜, 等電點時加入更易沉淀, 不同蛋白質(zhì)所需溶劑濃度不同分級沉淀, 但易引起變性，與有機溶劑濃度、作用時間和沉淀溫度有關 29. 雙縮脲反應： 肽鍵能與堿性銅溶液產(chǎn)生蘭色絡合物，肽鍵越多顏色越深，此稱為雙縮脲反應 30. 酚試劑反應 ：在堿性條件下, Tyr和Trp可與含磷鎢酸-磷鉬酸的酚試劑化合物生成蘭色物, 蘭色強度與蛋白質(zhì)量成正比, 此為測定蛋白質(zhì)常用方法, 靈敏度高(微克級 31. 包含體（IB）：大腸桿菌高效表達時形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白顆粒 32. Sanger法: 2,4-二硝基氟苯 (DNFB)與N端氨基進行烷化反應, 生成二硝基

9、苯衍生物, 酸水解得到黃色DNP-氨基酸, 并可用乙醚抽提再進行色譜分析 二甲基氨基萘磺酰氯（Dabsyl choride法）： Dabsyl choride與非解離狀態(tài)的?氨基作用, 進一步水解后可得到有色Dabsylated-氨基酸 Edman 法：苯異硫腈(PITC) 可與?氨基反應生成PTC-多肽, 酸水解后得到PTC-氨基酸, 后者可用乙酸乙酯抽提后進行鑒定,此法為氨基酸自動分析的基礎 羧肽酶法: 羧肽酶A 水解脂肪或芳香族氨基酸的C-末端, 羧肽酶B水解堿性氨基酸的C-末端 33.蛋白質(zhì)組學 ： 不是一個封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識體系,而是一個領域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表

10、達模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組序列與基因功能之間的橋梁 34.質(zhì)譜技術： 它通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)的種類 35.抗體酶（Abzyme) ： 抗體酶 或催化抗體（Catalytic antibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性 36.抗原和抗體： 當外源物性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、顆粒（細菌、細胞、病毒）進入人或動物體內(nèi)時，機體的免疫系統(tǒng)便產(chǎn)生相應的免疫球蛋白（immune globin），并以之結(jié)合，以消除異物的毒害。此反應稱為

11、免疫反應，此異物便是抗原，此球蛋白便是抗體。 37.Claisen重排 ：Claisen 重排是個協(xié)同反應，中間經(jīng)過一個環(huán)狀過渡態(tài)，所以芳環(huán)上取代基的電子效應對重排無影響。 38.Diels-Alder反應 ： 是指含有共軛二烯結(jié)構(gòu)的雙烯體和含不飽和鍵的親雙烯體，通過1，4-加成得到環(huán)狀烯烴，故又稱為雙烯合成反應 39. 酶聯(lián)免疫吸附分析： 是將酶作為標記物質(zhì)，使之和抗原（或抗體）結(jié)合形成酶與抗原（或抗體）復合物，然后再根據(jù)待測抗體（或抗原）與復合物專一且定量的結(jié)合關系，通過測定待測抗體（或抗原）結(jié)合的標記酶活力，從而計算出抗原或抗體的量。 核酸專題 1. DNA的一級結(jié)構(gòu)（堿基順序）： 是指

12、DNA分子中核苷酸的排列順序,由于核苷酸之間的差異僅僅是堿基的不同，故可稱為堿基順序 2.DNA物理圖譜： 是指DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序,即酶切片段在DNA鏈上的定位。 3.大溝和小溝： 雙螺旋的表面形成兩條凹 槽，一條寬而深，叫做大溝，一條狹而淺，叫做小溝。 4. 回文結(jié)構(gòu)(palindrome）：即旋轉(zhuǎn)對稱順序，在遺傳學上順讀和倒讀都一樣的DNA或RNA順序 5. 三螺旋DNA： 也稱H-DNA，在較低pH 條件下，包含較長多聚嘌呤與多聚嘧啶配對的DNA片段，在不破壞Watson-Crick堿基配對的情況下，通過Hoogsteen堿基配對而形成局部DNA三股螺旋。 6.反義RNA

13、(antisense RNA)： 指與mRNA互補的RNA分子，這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯。 7. 超螺旋（supercoil）：，就是螺旋的螺旋，是雙螺旋的中心軸再形成螺旋 8. polyA：多數(shù)真核生物mRNA的3末端有聚腺苷酸順序，稱polyA，由polyA聚合酶催化RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的hnRNA的末端形成的 9.snRNA ：除mRNA、rRNA及tRNA三大類主要RNA外，近年發(fā)現(xiàn)真核細胞尚含有一類非常重要的獨特RNA，分子都相對較小，約含70300個核苷酸，只存在于細胞核中，稱為小核RNA（small nuclear RNA， sn

14、RNA）。含量雖不到細胞總RNA的1%，但每個細胞核所含snRNA的拷貝數(shù)卻多達100萬個。 10.中度重復序列：指在真核基因組中重復數(shù)十至數(shù)萬（<105）次的重復順序 低度重復順序：在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，因而復性速度很慢 11.多基因家族（multi-gene family）：是指由某一祖先基因經(jīng)過重復和變異所產(chǎn)生的一組基因。分為兩類：一類是基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)；另一類是一個基因家族的不同成員成簇地分布不同染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關的蛋白質(zhì)。 12. 假基因（pseudogene）：在多基因家族中，某些成員

15、并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因（pseudogene）。 13. 自私DNA：只有很小一部份具有重要的調(diào)節(jié)功能，絕大部分都沒有特殊功用，似 乎只是自身復制，所以稱這類DNA為自私DNA或寄生DNA (parasite DNA) 14. 變性：由天然狀態(tài)到無規(guī)則狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程叫做變性（denature），又稱為熔解(melting)。能使DNA變性的試劑叫做變性劑， 15. 增色效應：DNA變性時，有序的堿基排列被打亂了，于是增加了對光的吸收，由于DNA變性而引起的光吸收的增加稱為增色效應（hyperchromicity）。 16. 解鏈溫度（melting temperature

16、,Tm）:核酸加溫變性過程中， A260達到最大值一半時的溫度 17. 退火（annealing）：變性DNA在一定條件下又可以恢復天然DNA的結(jié)構(gòu)，這個過程叫做復性(renaturation)，也叫退火（annealing）。 18.分子雜交(簡稱雜交,hybridization)： 是應用核酸分子的變性和復性的特性,使來源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子 探針：是指帶有某些標記物的特異性核酸序列片段。 19. 核糖核酸酶P(RNaseP)：是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3'-OH 和 5'-

17、磷酸末端。 生物化學大題總結(jié) 一、基因工程研究應包括主要內(nèi)容或步驟： 答：1）從復雜的生物有機體基因中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等方法，分離出帶有目的基因的DNA片段。 2）在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制，并帶有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子。 3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞，并與之一起增殖。 4）從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。 5）從這些篩選出來的受體細胞克隆中提取已經(jīng)得到擴增的目的基因，并做序列分析等鑒定。 6）將目的基因克隆到表達載體上，導入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)

18、。 二、向細胞內(nèi)導入外源正常基因，進行基因治療的技術已日趨完 善，常用的方法有四類： 答：1）利用RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒（SV40、腺病毒和牛乳頭瘤病毒）作為載體2）磷酸鈣沉淀等化學方法3）融合法、用脂質(zhì)體/紅細胞殼和原生質(zhì)體等薄膜包裹DNA與細胞融合4）顯微微量注射、電導入等物理方法 三、核酸疫苗的優(yōu)點：潛在危險 § 提供給免疫系統(tǒng)天然的抗原成分 § 單次接種即可獲得長期或終身免疫 § 免疫應答全面，既可誘導體液免疫又可誘導細胞免疫 § 多價疫苗具有廣泛的交叉保護作用 § 沒有減毒或滅活疫苗可能引起的致病作用 § 生產(chǎn)簡便、成

19、本低廉、質(zhì)量易控制、貯運方便 危險：DNA可能會整合到染色體上，影響染色體的穩(wěn)定性，引起細胞死亡或激活癌基因； DNA免疫接種后可能引起免疫系統(tǒng)本身的功能紊亂。 四：核酸分子雜交（菌落、噬菌體原位雜交法原理： 答：根據(jù)核酸的堿基互補配對原則，核酸標記的特異DNA或RNA探針只能與特異的基因雜交，用一定的方法將細菌的DNA或RNA固定在硝酸纖維素膜（或尼龍膜）上，在適合的條件（如離子強度、溫度）下用特異標記核酸探針與之雜交，標記探針就與特異基因牢固結(jié)合，將非特異結(jié)合探針洗去后，經(jīng)放射自顯影后，就可指示有特異DNA片段重組子的位置。 五：cDNA文庫構(gòu)建技術路線 六、生物大分子分離純化的一般步驟和

20、原則 生物組織 提取液 粗產(chǎn)品 ： 1前處理：材料選擇與處理 ，細胞破碎（機械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學處理 2粗分離：鹽析（硫酸銨鹽析），等電點沉淀，有機溶劑沉淀，離心 3細分離：分子大小，溶解度，電荷性質(zhì)，吸附性質(zhì)，生物親和力 七、細胞的破碎: 一、機械破碎 1.研磨法2.組織搗碎器法3.超聲波法 4.壓榨法5.凍溶法二、溶脹和自溶三、化學處理 （脂溶性溶劑、表面活性劑） 四、生物酶降解 （溶菌酶、蛋白酶、蝸牛酶） 八、抽提有效成分的影響因子 層析法（凝膠過濾，離子交換，親和層析） 電泳法（非變性PAGE，SDS-PAGE，等點聚焦） 超離心法 透析和超濾 1.pH值 偏離等電點 堿性

21、pH<pI 酸性 pH>pI 2.溶劑的極性和離子強度蔗糖甘油二甲基亞砜二甲基甲酰胺鹽析鹽溶 3.水解酶本身水解酶的作用（胰島素與胰蛋白酶原共存于胰腺）抑制劑（表1-3） 4.溫度低溫有利，但有例外 5.攪拌易產(chǎn)生泡沫導致蛋白質(zhì)變性 6.氧化巰基易被氧化/巰基乙醇，半胱氨酸，谷胱甘肽，維C，二硫蘇糖醇（多酚氧化酶） 7.金屬離子蛋白-金屬離子沉淀，EDTA絡合劑(1-3mmol/L) 8.抽提液與抽提物的比例(5:1) 九、濃 縮 一、沉淀法中性鹽，有機溶劑（經(jīng)透析，凝膠過濾脫鹽） 二、吸附法干膠（對有效成分性質(zhì)無影響，吸附力不強） 三、超過濾法加壓過濾（小量可手工，半透膜孔徑大小

22、掌握好） 四、透析法一定濃度的PEG（30%）、甘油（50%） 五、減壓蒸餾法圖1-3（適用于常溫下穩(wěn)定的物質(zhì)） 六、冰凍干燥法 冰凍抽提液（固）在真空狀態(tài)下直接變?yōu)闅怏w。有效成分幾乎不損失。適用于量小、純化的最后步驟。 十、生物大分子分離純化的一般步驟和原則 十二、鹽析曲線制作 曲線制作步驟：1.取一定體積已測含量之蛋白質(zhì)或酶的待分離溶液，調(diào)pH至穩(wěn)定范圍，分610次加入不同量的硫酸銨。 2.第一次加硫酸銨到溶液出現(xiàn)微弱混濁狀態(tài)時，靜置一段時間，離心或過濾即得到第一個分級沉淀部分。 3.以同樣的操作加硫酸銨到上清液或過濾液中，則得到第二個分級沉淀部分。 4.如此連續(xù)進行，便可得到610個分級

23、沉淀部分. 5.將每個分級沉淀部分分別重新溶解于一定體積的適宜pH緩沖液中，根據(jù)其蛋白質(zhì)或酶含量和相對應的硫酸銨濃度之間的關系作圖，即可的如圖2-1所示的鹽析曲線. 6.在此曲線的基礎上，參照表2-3的分級試驗方法，根據(jù)材料來源的難易程度、有效成分純度和得率要求等做出判斷。 十三、層析技術原理 ?層析技術是一種物理的分離方法。無論何種層析,都是由互不相溶的兩個相組成:一是固定相(固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同

24、組分以不同速度移動而最終被分離。 ?混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)(distribution coefficient,Kd）來描述。混合物各組分的分配系數(shù)差異越大，越容易分離開。 ?物質(zhì)在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于其Kd，而取決于它的有效分配系數(shù)Keff := 一物質(zhì)在A相中的總量/某一物質(zhì)在B相中的總量 十四、 十五、吸附層析 原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附

25、，從而以不同速度隨流動相向前移動。 載體 ： 硅膠 氧化鋁 羥基磷灰石 活性碳 應用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物質(zhì) 十六、洗脫濟的條件：純度高：穩(wěn)定性好：能完全洗脫下的分離組分：粘度??；易和所需要成分分開 十七 、 十八分 配 層 析 原理：分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相（展開劑）。當流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的溶質(zhì)在水和有機相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。 載體 ：纖維素 硅藻土 硅膠（柱、紙、薄層等形式） 十九、離子交換層析 基本原

26、理：離子交換劑 由三部分組成：基質(zhì)+電荷基團+反離子 水中呈不容解，可釋放出反離子 反離子可與溶液中其他離子或離子化合物進行可逆交換 離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力： 與離子的電荷量成正比，半徑的平方成 反比 因此，離子交換劑對各種離子或 離子化合物有不同的結(jié)合力 1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換 3、4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用 二十 離子交換劑的分類及性質(zhì) 實用的離子交換劑應滿足下列要求： 有高度的不溶性，即在各種溶劑中進行交換時，交換劑不發(fā)生溶解； 有疏

27、松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進行自由擴散和交換； 有較多的交換基因； 有穩(wěn)定的化學物理性質(zhì)，在使用過程中，交換劑不能因物理或化學因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。 一、分類 根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可將其分成兩大類： 1疏水性離子交換劑：其基質(zhì)是人工合成與水結(jié)合力較小的樹脂 陽離子交換劑：反離子帶正電荷，分強酸型、中強酸型、弱酸型 陰離子交換劑：與負離子或基團交換，有強堿、中強堿、弱減型 疏水性離子交換劑特點：交換容量大、機械強度大、流動速度快，適宜分離小分子物質(zhì)，少數(shù)新品可用于蛋白質(zhì)分離 2親水性離子交換劑：其基質(zhì)是天然或人工合成親水性大的物質(zhì) 纖維素離子交換

28、劑：以微晶纖維素為基質(zhì)，有酸堿性不同型號 交聯(lián)葡聚糖：以交聯(lián)葡聚糖G25和G50為基質(zhì)，（陽性和陰性） 瓊脂糖離子交換劑：以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B等為基質(zhì)（陰陽型號） 二十一離子交換劑的選擇 1。正確選擇陰陽離子交換劑 2。強弱型離子交換劑 的選擇生物大分子常用弱酸堿性離子交換劑 3。不同離子型交換劑的選擇 為提高交換容量，一般選擇結(jié)合力較小的反離子；強酸強堿型分別選擇H型和OH型； 弱酸弱堿型分別選擇Na和Cl型 4。不同基質(zhì)的選擇 生物大分子宜選用親水性基質(zhì)離子交換劑 緩沖液的選擇 1。緩沖液的pH和離子強度直接影響分離物的交換容量 2。起始緩沖液的pH和離子強度應有利于樣品中的有效成分與離

29、子交換劑結(jié)合，而雜質(zhì)不能結(jié)合?；蛘呦喾?。離子強度以0.1為宜。 用陰離子交換劑時緩沖液pH值比有效成分的pI值高一個單位 用陽離子交換劑時緩沖液pH值比有效成分的pI值低一個單位 3。洗脫液： 離子強度 陽離子交換劑 pH （逐漸接近pI ） 陰離子交換劑 4。緩沖液選擇的 關鍵在于了解有效成分的等電點，而未知樣品則需通過試驗來確定( 二十二離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型 操作步驟：取適量固體離子交換劑，先用水充分膨脹（沸水浴可加快膨脹過程），加過量水懸浮除去細顆粒（傾倒法），用酸堿浸泡以除去雜質(zhì)并使其帶上需要的 反離子， 疏水性離子交換劑用2-4倍的2M氫氧化鈉或2M鹽酸溶液處理 親水性離子交

30、換劑用0.5M氫氧化鈉+0.5M氯化鈉或0.5M鹽酸處理 （室溫下0.5小時） 酸堿處理的先后次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型 每次用酸堿處理后均應水洗至中性，再用堿酸處理，最后用水洗將至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可裝柱。 再生和轉(zhuǎn)型均可用上述方法，轉(zhuǎn)型時視對離子交換劑反離子的要求而使用不同試劑。 二十三分子篩層析 原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60 年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短

31、，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。 基質(zhì) 葡聚糖凝膠（sephadex） 瓊脂糖凝膠（sepharose 二十四葡聚糖凝膠(Sephadex) 1.理化性質(zhì) 白色珠狀顆粒，帶有大量羥基，親水性好，性質(zhì)見表6-2 2.穩(wěn)定性 在溫和條件下穩(wěn)定 3.吸附性 凝膠本身具有弱堿性，適當提高離子強度（>0.05）后對堿性蛋白質(zhì)的吸附可解除。新購得凝膠對蛋白質(zhì)可有少量不可逆吸附，可用蛋白質(zhì)預層析消除。 二十五凝膠的選擇和處理 1.凝膠的選擇 A/型號 所選凝膠型號應與分離目的和分離物分子大小相適應，蛋白質(zhì)的分離多用

32、Sephadex G各型凝膠. 核酸用Bio-gel, Sephacryl或高于其分子質(zhì)量范圍型號的 Sephadex 除鹽用G-25，混和物間分子質(zhì)量差異越大，分離效果越好。 B/粒度 粒度有粗有細，但與交聯(lián)度無關，細顆粒相對裝柱易均一，分離效果好，但流速慢，宜用大直徑層析柱，適宜小量試驗。 2.凝膠用量的計算 依層析柱的體積和干膠的膨脹度計算 干膠用量（g）=柱體積（ml）/干膠膨脹度（ml/g） 二十六加樣與洗脫 1.加樣 加樣量的影響因素：柱的分辨率、測定被分離物的靈敏度、柱的大小、樣品的黏度等，而樣品體積、分離物在柱中的洗脫體積或分配系數(shù)、柱床體積、樣品黏度也直接影響柱的分辨率。 因

33、此，原則是：在一定范圍內(nèi)，加樣體積越小越好。 2.洗脫 A/ 洗脫液 通常是：磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、鹽溶液 （NaCl）、甚至是蒸餾水 B/ 流速 通過恒流泵或控制操作壓來實現(xiàn) 流速的控制與操作壓、柱的規(guī)格、基質(zhì)性質(zhì)密切相關 流速慢有利于提高分離效果，但太慢也會因樣品擴散影 響分離效果 四、柱的再生與保存 1.再生 重新平衡、逆向沖洗、倒出凝膠再生后重新裝柱 2.保存 洗滌后加防霉劑低溫保存（適合短時間） 二十七親 和 層 析 原理：利用生物大分子的特異的生物學性質(zhì)專一地對某一種或某一類物質(zhì)可通過次級鍵結(jié)合的特性（親和特性）進行純化的方法，與層析法結(jié)合起來就是親和層析法。親和層析

34、法使生物大分子的提純變得簡單、迅速和高效。 親和層析的親和力就像抗原-抗體、激素-受體、酶-底物間的作用力，是多種次級鍵共同作用的結(jié)果。 基本步驟：合適的配體L共價結(jié)合到基質(zhì)M上制成親和吸附劑或稱為固相載體ML把ML裝柱制成層析柱上樣洗脫 分類：特異性配體親和層析法配體為復雜生物大分子 通用性配體親和層析法配體為簡單小分子物質(zhì)， 基質(zhì)的條件： 1.極低的非特異吸附性2.高度的親水性 3.較好的理化穩(wěn)定性4.大量的化學基團能被活化且易與配體結(jié)合 5.適當?shù)亩嗫仔裕讖酱笮∨c篩孔多少） 二十九、電泳的一般原理 電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 。許多生物分子都帶有電荷，其

35、電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。 三十 sds聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理： 當SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS -蛋白質(zhì)復合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關系。 三十一、等電