發(fā)酵過程優(yōu)化與控賴氨酸發(fā)酵過程優(yōu)化

1、 一、發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸技術(shù)的發(fā)展一、發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸技術(shù)的發(fā)展 1、賴氨酸的生產(chǎn)方法、賴氨酸的生產(chǎn)方法 水解法水解法(已淘汰已淘汰)、合成法、酶法和直接發(fā)酵法。、合成法、酶法和直接發(fā)酵法。 合成法：合成法：以以己內(nèi)酰胺、二氫吡喃、環(huán)己酮、呱啶己內(nèi)酰胺、二氫吡喃、環(huán)己酮、呱啶為原料合為原料合成成L-賴氨酸已有報道，但還沒有大規(guī)模的生產(chǎn)報道，主要是合賴氨酸已有報道，但還沒有大規(guī)模的生產(chǎn)報道，主要是合成法制成的中間體成法制成的中間體DL-賴氨酸進(jìn)一步的分離工藝很復(fù)雜。賴氨酸進(jìn)一步的分離工藝很復(fù)雜。 酶法（酶法（3種）：種）：合成合成-苯甲酰苯甲酰-乙酰乙酰-DL-賴氨酸，采用消賴氨酸，采用消旋酶處理

2、制成旋酶處理制成-苯甲酰苯甲酰-L-賴氨酸，經(jīng)酸水解得產(chǎn)品；合成賴氨酸，經(jīng)酸水解得產(chǎn)品；合成DL-4-氨基丁基乙內(nèi)酰脲，采用微生物酶使其轉(zhuǎn)變?yōu)榘被』覂?nèi)酰脲，采用微生物酶使其轉(zhuǎn)變?yōu)長-賴氨酸；賴氨酸；由環(huán)己烯合成由環(huán)己烯合成DL-氨基己內(nèi)酰胺，采用水解酶和消旋酶共同氨基己內(nèi)酰胺，采用水解酶和消旋酶共同作用使其變成作用使其變成L-賴氨酸。賴氨酸。 第三種工藝已用于賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)。該法發(fā)明者富村隆第三種工藝已用于賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)。該法發(fā)明者富村隆最初找到了可水解最初找到了可水解L-氨基己內(nèi)酰胺的氨基己內(nèi)酰胺的羅倫隱球酵母羅倫隱球酵母，然后發(fā)現(xiàn)，然后發(fā)現(xiàn)了具有了具有DL-氨基己內(nèi)酰胺消旋酶活性的

3、氨基己內(nèi)酰胺消旋酶活性的無色桿菌無色桿菌，通過這兩種，通過這兩種細(xì)菌的共同作用，細(xì)菌的共同作用， DL-氨基己內(nèi)酰胺被轉(zhuǎn)化為氨基己內(nèi)酰胺被轉(zhuǎn)化為L-賴氨酸，且得賴氨酸，且得率高。率高。 發(fā)酵法：發(fā)酵法：原料來源廣泛，且生產(chǎn)的賴氨酸均為原料來源廣泛，且生產(chǎn)的賴氨酸均為L-型，在賴型，在賴氨酸的生產(chǎn)中占據(jù)了主導(dǎo)地位。生產(chǎn)賴氨酸的主要廠家見表氨酸的生產(chǎn)中占據(jù)了主導(dǎo)地位。生產(chǎn)賴氨酸的主要廠家見表4-1，其中其中90%以上的企業(yè)采用發(fā)酵法生產(chǎn)。以上的企業(yè)采用發(fā)酵法生產(chǎn)。 2、發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸、發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸 微生物的賴氨酸合成途徑在微生物的賴氨酸合成途徑在1950年以后逐漸被闡明。年以后逐漸被闡明。

4、對對結(jié)腸芽孢桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌的賴氨酸結(jié)腸芽孢桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌的賴氨酸合成途徑合成途徑解析后發(fā)現(xiàn)：賴氨酸的合成與其它氨基酸不同，存在解析后發(fā)現(xiàn)：賴氨酸的合成與其它氨基酸不同，存在兩條途徑即：二氨基二酸途徑和兩條途徑即：二氨基二酸途徑和-氨基乙二酸途徑，前者存在氨基乙二酸途徑，前者存在于細(xì)菌、綠藻、原生質(zhì)、高等植物中，后者存在于酵母菌、霉于細(xì)菌、綠藻、原生質(zhì)、高等植物中，后者存在于酵母菌、霉菌中。菌中。 1957年，日本開始采用野生菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，年，日本開始采用野生菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，1960年年用谷氨酸棒桿菌的高絲氨酸缺陷型變異株生產(chǎn)賴氨酸。用谷氨酸棒桿菌的

5、高絲氨酸缺陷型變異株生產(chǎn)賴氨酸。 20世紀(jì)世紀(jì)60年代中期，我國開始賴氨酸發(fā)酵菌株和工藝條件年代中期，我國開始賴氨酸發(fā)酵菌株和工藝條件研究。研究。1974年中科院微生物所誘變北京棒桿菌年中科院微生物所誘變北京棒桿菌AS 1.229得到營得到營養(yǎng)缺陷型變異株養(yǎng)缺陷型變異株AS 1.563，產(chǎn)酸，產(chǎn)酸17.9g/L，進(jìn)一步誘變得到，進(jìn)一步誘變得到AECr變異株，產(chǎn)酸變異株，產(chǎn)酸50g/L。 70年代后期，上海、黑龍江、廣西和江蘇等地積極開年代后期，上海、黑龍江、廣西和江蘇等地積極開展賴氨酸菌種篩選工作。如上海天廚味精廠得到展賴氨酸菌種篩選工作。如上海天廚味精廠得到AECr和和高絲氨酸缺陷雙突變株，

6、產(chǎn)酸高絲氨酸缺陷雙突變株，產(chǎn)酸3637g/L；中科院微生物所；中科院微生物所和常州味精廠合作篩選得到產(chǎn)酸和常州味精廠合作篩選得到產(chǎn)酸4853g/L的鈍齒棒桿菌，的鈍齒棒桿菌，通過發(fā)酵中試技術(shù)鑒定。上海工業(yè)微生物研究所從黃色短通過發(fā)酵中試技術(shù)鑒定。上海工業(yè)微生物研究所從黃色短桿菌桿菌2030出發(fā)經(jīng)誘變篩選得到抗性和營養(yǎng)缺陷型雙突變株，出發(fā)經(jīng)誘變篩選得到抗性和營養(yǎng)缺陷型雙突變株，其中的其中的FH-128菌株在菌株在16L小罐發(fā)酵小罐發(fā)酵70h產(chǎn)酸產(chǎn)酸130g/L以上，以上，5m3罐中試發(fā)酵罐中試發(fā)酵6569h，產(chǎn)酸，產(chǎn)酸92.295g/L，轉(zhuǎn)化率為，轉(zhuǎn)化率為40.2%左右，達(dá)到國際先進(jìn)水平，但至今

7、未有工業(yè)化報道。左右，達(dá)到國際先進(jìn)水平，但至今未有工業(yè)化報道。 廣西南寧賴氨酸廠于廣西南寧賴氨酸廠于80年代投產(chǎn)后，與廣西生物化工年代投產(chǎn)后，與廣西生物化工研究所協(xié)作一直進(jìn)行賴氨酸生產(chǎn)菌改良和發(fā)酵工藝改進(jìn)，研究所協(xié)作一直進(jìn)行賴氨酸生產(chǎn)菌改良和發(fā)酵工藝改進(jìn)，得到分別以糖蜜和淀粉糖為原料的高產(chǎn)菌株，以淀粉糖為得到分別以糖蜜和淀粉糖為原料的高產(chǎn)菌株，以淀粉糖為原料原料30L罐發(fā)酵產(chǎn)酸罐發(fā)酵產(chǎn)酸120130g/L左右，該廠還獲得了可耐高左右，該廠還獲得了可耐高溫生產(chǎn)菌，溫生產(chǎn)菌，37下發(fā)酵，賴氨酸產(chǎn)量基本不受影響。下發(fā)酵，賴氨酸產(chǎn)量基本不受影響。 江南大學(xué)江南大學(xué)20世紀(jì)世紀(jì)80年代從谷氨酸產(chǎn)酸菌年代

8、從谷氨酸產(chǎn)酸菌AS 1.495誘變賴誘變賴氨酸產(chǎn)酸菌氨酸產(chǎn)酸菌F11-519，產(chǎn)酸，產(chǎn)酸57.4g/L。再經(jīng)原生質(zhì)體融合和化。再經(jīng)原生質(zhì)體融合和化學(xué)、物理誘變等手段得到多重變異株學(xué)、物理誘變等手段得到多重變異株FB21，搖瓶產(chǎn)酸，搖瓶產(chǎn)酸70g/L，為當(dāng)時的國內(nèi)領(lǐng)先水平，但未進(jìn)行發(fā)酵中試和工業(yè)化。為當(dāng)時的國內(nèi)領(lǐng)先水平，但未進(jìn)行發(fā)酵中試和工業(yè)化。 綜上所述，國內(nèi)賴氨酸研究起步較早，但高產(chǎn)菌實現(xiàn)工業(yè)綜上所述，國內(nèi)賴氨酸研究起步較早，但高產(chǎn)菌實現(xiàn)工業(yè)化比例低；另外，研究多局限于菌種改良和優(yōu)化發(fā)酵的環(huán)境條化比例低；另外，研究多局限于菌種改良和優(yōu)化發(fā)酵的環(huán)境條件，對各種培養(yǎng)條件下的優(yōu)化控制研究不多，或與

9、實際生產(chǎn)脫件，對各種培養(yǎng)條件下的優(yōu)化控制研究不多，或與實際生產(chǎn)脫節(jié)。節(jié)。 3、我國賴氨酸發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)狀、我國賴氨酸發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)狀 20世紀(jì)世紀(jì)80年代初，國內(nèi)開始進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵中試，并興建年代初，國內(nèi)開始進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵中試，并興建賴氨酸發(fā)酵廠，特點是產(chǎn)酸水平和轉(zhuǎn)化率低、規(guī)模小。賴氨酸發(fā)酵廠，特點是產(chǎn)酸水平和轉(zhuǎn)化率低、規(guī)模小。“七五七五”期間，國家在期間，國家在廣西南寧、福建泉州、湖北武漢及吉林九站廣西南寧、福建泉州、湖北武漢及吉林九站建了建了4套年產(chǎn)套年產(chǎn)1kt賴氨酸生產(chǎn)裝置。后兩家已經(jīng)改產(chǎn)或停產(chǎn)，福建泉州賴氨酸生產(chǎn)裝置。后兩家已經(jīng)改產(chǎn)或停產(chǎn)，福建泉州賴氨酸廠賴氨酸廠1989年與正大集團(tuán)合資后改名

10、為年與正大集團(tuán)合資后改名為“泉州大泉賴氨酸有泉州大泉賴氨酸有限公司限公司”，生產(chǎn)能力，生產(chǎn)能力5kt/a左右，使用國外菌種和技術(shù)。廣西南左右，使用國外菌種和技術(shù)。廣西南寧賴氨酸廠具有寧賴氨酸廠具有6kt/a生產(chǎn)能力。此外，還有四川川化味之素公生產(chǎn)能力。此外，還有四川川化味之素公司具有司具有6kt/a生產(chǎn)能力，使用日本菌種和技術(shù)。生產(chǎn)能力，使用日本菌種和技術(shù)。 以上三家企業(yè)為我國最主要的賴氨酸生產(chǎn)廠家，其總生產(chǎn)以上三家企業(yè)為我國最主要的賴氨酸生產(chǎn)廠家，其總生產(chǎn)能力也不過略高于能力也不過略高于1.5萬萬t/a，而僅美國，而僅美國ADM公司年產(chǎn)賴氨酸就達(dá)公司年產(chǎn)賴氨酸就達(dá)12萬萬t/a。廣西南寧賴氨

11、酸廠是唯一擁有自己的菌種和技術(shù)的國。廣西南寧賴氨酸廠是唯一擁有自己的菌種和技術(shù)的國內(nèi)賴氨酸生產(chǎn)企業(yè)，該廠主要以糖蜜為原料，產(chǎn)酸達(dá)到內(nèi)賴氨酸生產(chǎn)企業(yè)，該廠主要以糖蜜為原料，產(chǎn)酸達(dá)到80g/L以以上，對糖轉(zhuǎn)化率上，對糖轉(zhuǎn)化率38%左右，在國內(nèi)屬先進(jìn)水平。但跟日本等國左右，在國內(nèi)屬先進(jìn)水平。但跟日本等國的賴氨酸生產(chǎn)水平（日本味之素公司發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸鹽酸鹽的賴氨酸生產(chǎn)水平（日本味之素公司發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸鹽酸鹽濃度為濃度為120g/L，轉(zhuǎn)化率可達(dá)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%）相比有很大差距。）相比有很大差距。 二、賴氨酸發(fā)酵研究的目的和主要內(nèi)容二、賴氨酸發(fā)酵研究的目的和主要內(nèi)容 賴氨酸在我國具有廣闊的市場，我國

12、賴氨酸生產(chǎn)技術(shù)雖然賴氨酸在我國具有廣闊的市場，我國賴氨酸生產(chǎn)技術(shù)雖然取得了長足的進(jìn)步，但與國外先進(jìn)水平相比（如產(chǎn)酸水平、糖取得了長足的進(jìn)步，但與國外先進(jìn)水平相比（如產(chǎn)酸水平、糖酸轉(zhuǎn)化率、提取率、生產(chǎn)規(guī)模、電耗、生產(chǎn)成本比值）都存在酸轉(zhuǎn)化率、提取率、生產(chǎn)規(guī)模、電耗、生產(chǎn)成本比值）都存在差距。差距。 發(fā)酵水平的高低是工廠的命脈，提高發(fā)酵水平有兩條途發(fā)酵水平的高低是工廠的命脈，提高發(fā)酵水平有兩條途徑：一是篩選出優(yōu)良的菌株；二是得出與目的菌株相匹配的徑：一是篩選出優(yōu)良的菌株；二是得出與目的菌株相匹配的最佳培養(yǎng)條件、控制手段，只有兩者緊密結(jié)合才能最終實現(xiàn)最佳培養(yǎng)條件、控制手段，只有兩者緊密結(jié)合才能最終實

13、現(xiàn)發(fā)酵的高水平。后者正在占據(jù)著越來越重要的地位。例如，發(fā)酵的高水平。后者正在占據(jù)著越來越重要的地位。例如，味之素公司研究人員曾報道，乳糖發(fā)酵短桿菌變異株味之素公司研究人員曾報道，乳糖發(fā)酵短桿菌變異株AJ11204在搖瓶條件下在搖瓶條件下48h產(chǎn)賴氨酸為產(chǎn)賴氨酸為4.3%，但在小型發(fā)酵罐中，通，但在小型發(fā)酵罐中，通過控制培養(yǎng)條件，過控制培養(yǎng)條件，48h產(chǎn)酸水平可提高到產(chǎn)酸水平可提高到7%，類似的結(jié)果在，類似的結(jié)果在其它發(fā)酵產(chǎn)品的研究中也時有報道。其它發(fā)酵產(chǎn)品的研究中也時有報道。 我國學(xué)者對賴氨酸的研究長期以來都把工作重點放在高我國學(xué)者對賴氨酸的研究長期以來都把工作重點放在高產(chǎn)菌株的選育上，有關(guān)如

14、何對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化與控制的研產(chǎn)菌株的選育上，有關(guān)如何對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化與控制的研究較少。究較少。 實際生產(chǎn)需要的一些培養(yǎng)條件、技術(shù)指標(biāo)往往在搖瓶條實際生產(chǎn)需要的一些培養(yǎng)條件、技術(shù)指標(biāo)往往在搖瓶條件下獲得，這種低水平的研究方法客觀上制約了菌種潛力的件下獲得，這種低水平的研究方法客觀上制約了菌種潛力的充分發(fā)揮，不僅如此，由于在搖瓶條件下無法對目的微生物充分發(fā)揮，不僅如此，由于在搖瓶條件下無法對目的微生物生理生化特性、營養(yǎng)供給及操作、發(fā)酵設(shè)備三者之間建立起生理生化特性、營養(yǎng)供給及操作、發(fā)酵設(shè)備三者之間建立起有機(jī)的聯(lián)系，當(dāng)反應(yīng)器規(guī)模發(fā)生變化時發(fā)酵結(jié)果常常不能重有機(jī)的聯(lián)系，當(dāng)反應(yīng)器規(guī)模發(fā)生變化時發(fā)酵結(jié)

15、果常常不能重復(fù)。這是導(dǎo)致生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大而發(fā)酵水平降低的根本原因。復(fù)。這是導(dǎo)致生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大而發(fā)酵水平降低的根本原因。 實現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)化，使菌種的潛力充分發(fā)揮是發(fā)酵技實現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)化，使菌種的潛力充分發(fā)揮是發(fā)酵技術(shù)的最高境界。鑒于國內(nèi)賴氨酸高產(chǎn)菌株多集中于黃色短桿術(shù)的最高境界。鑒于國內(nèi)賴氨酸高產(chǎn)菌株多集中于黃色短桿菌，以此為研究菌株，陳堅等以實現(xiàn)流加發(fā)酵最優(yōu)化為研究菌，以此為研究菌株，陳堅等以實現(xiàn)流加發(fā)酵最優(yōu)化為研究目的，在小型反應(yīng)器上對黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的過程目的，在小型反應(yīng)器上對黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的過程進(jìn)行了定量的解析。具體包括以下內(nèi)容：進(jìn)行了定量的解析。具體包括以下內(nèi)容： 在所

16、提供的出發(fā)株基礎(chǔ)上，通過常規(guī)誘變獲得一株賴在所提供的出發(fā)株基礎(chǔ)上，通過常規(guī)誘變獲得一株賴氨酸產(chǎn)生菌氨酸產(chǎn)生菌FB42，在搖瓶條件下對可能影響代謝的環(huán)境因子，在搖瓶條件下對可能影響代謝的環(huán)境因子進(jìn)行了考察，對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化；進(jìn)行了考察，對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化； 以連續(xù)培養(yǎng)作為研究手段，考察了微生物的菌體生長、以連續(xù)培養(yǎng)作為研究手段，考察了微生物的菌體生長、產(chǎn)物形成及基質(zhì)消耗特性。通過代謝途徑進(jìn)行定量的質(zhì)、能產(chǎn)物形成及基質(zhì)消耗特性。通過代謝途徑進(jìn)行定量的質(zhì)、能衡算，得出了賴氨酸的理論轉(zhuǎn)化率。進(jìn)一步比較理論轉(zhuǎn)化率衡算，得出了賴氨酸的理論轉(zhuǎn)化率。進(jìn)一步比較理論轉(zhuǎn)化率和和FB42真實轉(zhuǎn)化率之間的差異，

17、對真實轉(zhuǎn)化率之間的差異，對FB42的代謝流進(jìn)行分析，的代謝流進(jìn)行分析，據(jù)此得出對工藝研究有指導(dǎo)的一些理論依據(jù)；據(jù)此得出對工藝研究有指導(dǎo)的一些理論依據(jù)； 在小型反應(yīng)器中對影響賴氨酸形成的一些重要環(huán)境因在小型反應(yīng)器中對影響賴氨酸形成的一些重要環(huán)境因子進(jìn)行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、營養(yǎng)子進(jìn)行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、營養(yǎng)源供給與反應(yīng)器特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，得出最適的操作條件。源供給與反應(yīng)器特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，得出最適的操作條件。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對發(fā)酵過程的動力學(xué)進(jìn)行研究，建立起合在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對發(fā)酵過程的動力學(xué)進(jìn)行研究，建立起合理的動力學(xué)模型，為流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究打

18、下基礎(chǔ)；理的動力學(xué)模型，為流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究打下基礎(chǔ)； 在動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上對發(fā)酵進(jìn)行最優(yōu)化操作。包括在動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上對發(fā)酵進(jìn)行最優(yōu)化操作。包括狀態(tài)方程的建立、目標(biāo)泛函的確定、最優(yōu)化流加方式的求解。狀態(tài)方程的建立、目標(biāo)泛函的確定、最優(yōu)化流加方式的求解。并通過實驗對最優(yōu)化操作進(jìn)行檢驗，達(dá)到理論和實踐的統(tǒng)一。并通過實驗對最優(yōu)化操作進(jìn)行檢驗，達(dá)到理論和實踐的統(tǒng)一。第二節(jié)、賴氨酸生產(chǎn)菌第二節(jié)、賴氨酸生產(chǎn)菌FB42的獲得的獲得 一、出發(fā)菌株一、出發(fā)菌株FB21的遺傳特性：的遺傳特性：P81 二、二、FB31菌株搖瓶發(fā)酵性能的初步研究菌株搖瓶發(fā)酵性能的初步研究 FB31是由是由FB21（主要遺傳標(biāo)記

19、為（主要遺傳標(biāo)記為Leu-Thr- AECrAHVr ）的保藏斜面中接出，經(jīng)復(fù)壯、分離、純化后獲得。其主要遺的保藏斜面中接出，經(jīng)復(fù)壯、分離、純化后獲得。其主要遺傳標(biāo)記為傳標(biāo)記為Leu-、AECr、AHVr。 1、種齡的確定、種齡的確定 適宜的種齡應(yīng)是菌體處于對數(shù)生長期的中后期。因為處適宜的種齡應(yīng)是菌體處于對數(shù)生長期的中后期。因為處于對數(shù)生長期的菌體接種有利于縮短發(fā)酵周期，對數(shù)生長期于對數(shù)生長期的菌體接種有利于縮短發(fā)酵周期，對數(shù)生長期末菌體濃度相對較高，更有利于保持高的接種量。末菌體濃度相對較高，更有利于保持高的接種量。 從圖從圖4-2的生長曲線上可看出，培養(yǎng)進(jìn)行到的生長曲線上可看出，培養(yǎng)進(jìn)行到

20、1719h時，時，F(xiàn)B31處于對數(shù)生長期末，所以選擇種齡為處于對數(shù)生長期末，所以選擇種齡為1719h。 2、接種量對發(fā)酵的影響、接種量對發(fā)酵的影響 培養(yǎng)培養(yǎng)1719h的新鮮種子按不同的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基的新鮮種子按不同的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)表中，根據(jù)表4-3的結(jié)果，接種量以的結(jié)果，接種量以5%為好。為好。 但進(jìn)一步的實驗又表明接種量以但進(jìn)一步的實驗又表明接種量以8%為好（表為好（表4-4）。）。 導(dǎo)致上述結(jié)果的根本原因在于缺乏菌體濃度作為衡量標(biāo)導(dǎo)致上述結(jié)果的根本原因在于缺乏菌體濃度作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。接種量為準(zhǔn)。接種量為5%時，菌體濃度較高（時，菌體濃度較高（OD=0.180.2）;接種量

21、接種量為為8%時，菌體濃度較低（時，菌體濃度較低（OD=0.085）。）。 同樣培養(yǎng)時間條件下引起菌體濃度出現(xiàn)差異的可能原因同樣培養(yǎng)時間條件下引起菌體濃度出現(xiàn)差異的可能原因包括包括:溫差、斜面接種量波動或其它因素。溫差、斜面接種量波動或其它因素。 3、初糖濃度對發(fā)酵的影響、初糖濃度對發(fā)酵的影響 表表4-5的結(jié)果表明：初糖濃度的結(jié)果表明：初糖濃度13%時發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率最高，時發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率最高，進(jìn)一步提高初糖濃度對發(fā)酵不利，當(dāng)初糖濃度為進(jìn)一步提高初糖濃度對發(fā)酵不利，當(dāng)初糖濃度為18%時，時，F(xiàn)B31幾乎不產(chǎn)酸，說明菌株不具備耐高糖的特性。幾乎不產(chǎn)酸，說明菌株不具備耐高糖的特性。 4、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

22、、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 在固定葡萄糖、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂和碳酸鈣用在固定葡萄糖、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂和碳酸鈣用量基礎(chǔ)上，對玉米漿、豆餅水解液、硫酸銨等氮源物質(zhì)通過量基礎(chǔ)上，對玉米漿、豆餅水解液、硫酸銨等氮源物質(zhì)通過正交實驗，得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最適組成為（正交實驗，得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最適組成為（g/L）：）： 葡萄糖葡萄糖130 玉米漿玉米漿 30 豆餅水解液豆餅水解液 10 硫酸銨硫酸銨 40 磷酸氫磷酸氫二鉀二鉀 1 七水合硫酸鎂七水合硫酸鎂 0.5 碳酸鈣碳酸鈣 45 用該培養(yǎng)基發(fā)酵用該培養(yǎng)基發(fā)酵72h，產(chǎn)酸為，產(chǎn)酸為42g/L，和，和FB21（70g/L）相）相比產(chǎn)酸性能下降很多。結(jié)合

23、遺傳標(biāo)記的改變、發(fā)酵產(chǎn)酸水平比產(chǎn)酸性能下降很多。結(jié)合遺傳標(biāo)記的改變、發(fā)酵產(chǎn)酸水平和耐糖能力的降低，表明和耐糖能力的降低，表明FB31發(fā)生了回復(fù)突變。發(fā)生了回復(fù)突變。 防止回復(fù)突變目前通常采用如下辦法：防止回復(fù)突變目前通常采用如下辦法： 選育遺傳性能穩(wěn)定的菌株。經(jīng)誘變處理后，在易出選育遺傳性能穩(wěn)定的菌株。經(jīng)誘變處理后，在易出現(xiàn)回復(fù)突變的培養(yǎng)基中反復(fù)傳代，選出不發(fā)生回復(fù)突變的現(xiàn)回復(fù)突變的培養(yǎng)基中反復(fù)傳代，選出不發(fā)生回復(fù)突變的菌株；菌株； 定向賦加生產(chǎn)菌的遺傳標(biāo)記。如選育雙缺菌株，增定向賦加生產(chǎn)菌的遺傳標(biāo)記。如選育雙缺菌株，增加抗回復(fù)突變性能；對于抗性株，盡量選育多重抗性突變加抗回復(fù)突變性能；對于抗

24、性株，盡量選育多重抗性突變株；株； 在保藏過程中除選擇合理的保藏方法外，對于營養(yǎng)在保藏過程中除選擇合理的保藏方法外，對于營養(yǎng)缺陷型菌株要提供足夠的營養(yǎng)物，抗性株可添加適量的抗缺陷型菌株要提供足夠的營養(yǎng)物，抗性株可添加適量的抗性物質(zhì)；性物質(zhì)； 必須定期進(jìn)行分離、純化工作，保持其遺傳性能的必須定期進(jìn)行分離、純化工作，保持其遺傳性能的穩(wěn)定。穩(wěn)定。三、賴氨酸生產(chǎn)菌三、賴氨酸生產(chǎn)菌FB42的獲得的獲得 1、黃色短桿菌產(chǎn)賴氨酸的合成途徑與調(diào)控機(jī)制、黃色短桿菌產(chǎn)賴氨酸的合成途徑與調(diào)控機(jī)制 黃色短桿菌產(chǎn)黃色短桿菌產(chǎn)12種氨基酸的合成代謝途徑如圖種氨基酸的合成代謝途徑如圖4-3所示。所示。葡萄葡萄糖糖磷酸烯醇式

25、丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸丙酮酸乙酰輔酶乙酰輔酶草酰乙酸草酰乙酸-酮戊二酸酮戊二酸天冬氨酸天冬氨酸丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸丙氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸纈氨酸纈氨酸谷氨酸谷氨酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛高絲氨酸高絲氨酸蘇氨酸蘇氨酸蛋氨酸蛋氨酸賴氨酸賴氨酸TCA反饋阻遏反饋阻遏反饋抑制反饋抑制 圖圖4-3中，氨基酸的代謝途徑有中，氨基酸的代謝途徑有3條：從葡萄糖經(jīng)條：從葡萄糖經(jīng)丙酮酸到丙氨酸、纈氨酸；從葡萄糖經(jīng)草酰乙酸和丙酮酸到丙氨酸、纈氨酸；從葡萄糖經(jīng)草酰乙酸和-酮戊二酸到谷氨酸；從葡萄糖經(jīng)天門冬氨酸、天門冬酮戊二酸到谷氨酸；從葡萄糖經(jīng)天門冬氨酸、天門冬氨酸半醛到賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸。氨酸半

26、醛到賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸。 第三條代謝途徑即賴氨酸合成途徑存在著嚴(yán)格的調(diào)第三條代謝途徑即賴氨酸合成途徑存在著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)機(jī)制，正常的細(xì)胞幾乎不積累賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨節(jié)機(jī)制，正常的細(xì)胞幾乎不積累賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸。該調(diào)節(jié)機(jī)制由下面幾種調(diào)節(jié)作用共同完成：酸。該調(diào)節(jié)機(jī)制由下面幾種調(diào)節(jié)作用共同完成： 、谷氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過剩就會抑制谷、谷氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過剩就會抑制谷氨酸脫氫酶（氨酸脫氫酶（GD）的活性，使得生物合成的代謝流轉(zhuǎn)向）的活性，使得生物合成的代謝流轉(zhuǎn)向天門冬氨酸。天門冬氨酸。 天門冬氨酸的過剩也會抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化天門冬氨酸的過剩也會抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活

27、性，使得天門冬氨酸不致大量積累。酶的活性，使得天門冬氨酸不致大量積累。 賴氨酸的前體物質(zhì)天門冬氨酸與乙酰輔酶賴氨酸的前體物質(zhì)天門冬氨酸與乙酰輔酶A的生成的生成形成平衡合成，乙酰輔酶形成平衡合成，乙酰輔酶A的增加能逆轉(zhuǎn)天門冬氨酸對其的增加能逆轉(zhuǎn)天門冬氨酸對其自身合成的反饋抑制。自身合成的反饋抑制。 天門冬氨酸激酶（天門冬氨酸激酶（AK）受賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同）受賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同反饋。反饋。 AK是一個變構(gòu)酶，催化天門冬氨酸和是一個變構(gòu)酶，催化天門冬氨酸和ATP形成形成-天天門冬氨酸磷酸，有兩個變構(gòu)位置可以接受末端產(chǎn)物。門冬氨酸磷酸，有兩個變構(gòu)位置可以接受末端產(chǎn)物。AK受賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑

28、制，當(dāng)只有賴氨酸或蘇氨酸與受賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制，當(dāng)只有賴氨酸或蘇氨酸與變構(gòu)位置結(jié)合時，酶活影響不大，當(dāng)賴氨酸與蘇氨酸同時變構(gòu)位置結(jié)合時，酶活影響不大，當(dāng)賴氨酸與蘇氨酸同時結(jié)合到兩個變構(gòu)位置時，酶活受到強烈的抑制。此外，結(jié)合到兩個變構(gòu)位置時，酶活受到強烈的抑制。此外，AK是賴氨酸合成途徑中唯一的反饋調(diào)節(jié)點。是賴氨酸合成途徑中唯一的反饋調(diào)節(jié)點。 賴氨酸分支途徑的其它酶，如第一個專一性酶賴氨酸分支途徑的其它酶，如第一個專一性酶二氫吡二氫吡啶二羧酸合成酶，末端產(chǎn)物如賴氨酸或其它氨基酸單獨或組合啶二羧酸合成酶，末端產(chǎn)物如賴氨酸或其它氨基酸單獨或組合對該酶無抑制作用，且該酶也不受賴氨酸的反饋阻遏。對

29、該酶無抑制作用，且該酶也不受賴氨酸的反饋阻遏。 賴氨酸亮氨酸的生物合成之間存在著代謝互鎖，賴氨酸賴氨酸亮氨酸的生物合成之間存在著代謝互鎖，賴氨酸分支途徑的初始酶二氫吡啶二羧酸合成酶為亮氨酸所阻遏。分支途徑的初始酶二氫吡啶二羧酸合成酶為亮氨酸所阻遏。 蛋氨酸比蘇氨酸優(yōu)先合成，蛋氨酸合成的過剩就會阻遏蛋氨酸比蘇氨酸優(yōu)先合成，蛋氨酸合成的過剩就會阻遏高絲氨酸高絲氨酸-O-轉(zhuǎn)乙酰酶，使得生物合成的代謝流轉(zhuǎn)向蘇氨酸。轉(zhuǎn)乙酰酶，使得生物合成的代謝流轉(zhuǎn)向蘇氨酸。蘇氨酸比賴氨酸優(yōu)先合成，蘇氨酸的過剩會反饋抑制高絲氨酸蘇氨酸比賴氨酸優(yōu)先合成，蘇氨酸的過剩會反饋抑制高絲氨酸脫羧酶的活性，使得生物合成轉(zhuǎn)向賴氨酸。脫

30、羧酶的活性，使得生物合成轉(zhuǎn)向賴氨酸。 2、賴氨酸產(chǎn)生菌的育種策略、賴氨酸產(chǎn)生菌的育種策略 根據(jù)前面對賴氨酸合成途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制的分析，賴氨酸發(fā)根據(jù)前面對賴氨酸合成途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制的分析，賴氨酸發(fā)酵屬于代謝控制發(fā)酵。酵屬于代謝控制發(fā)酵。 所謂代謝控制發(fā)酵是指微生物在正常代謝調(diào)控機(jī)制作用下，所謂代謝控制發(fā)酵是指微生物在正常代謝調(diào)控機(jī)制作用下，不會積累人們所需要的目的產(chǎn)物，通過用人工誘變等方法有目不會積累人們所需要的目的產(chǎn)物，通過用人工誘變等方法有目的地破壞其部分代謝調(diào)控機(jī)制，改變其固有的調(diào)節(jié)機(jī)制，使合的地破壞其部分代謝調(diào)控機(jī)制，改變其固有的調(diào)節(jié)機(jī)制，使合成產(chǎn)物的途徑暢通無阻，最大限度地積累目的產(chǎn)物。成

31、產(chǎn)物的途徑暢通無阻，最大限度地積累目的產(chǎn)物。 結(jié)合黃色短桿菌的賴氨酸合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)制，相應(yīng)結(jié)合黃色短桿菌的賴氨酸合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)制，相應(yīng)的育種策略可歸納如下：的育種策略可歸納如下： 切斷代謝支路：選育和應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株，切斷丙氨切斷代謝支路：選育和應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株，切斷丙氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸的分支途徑是積累賴氨酸的有效手段。酸、蘇氨酸和蛋氨酸的分支途徑是積累賴氨酸的有效手段。 解除反饋抑制：選育抗結(jié)構(gòu)類似物的突變株，可以得到解除反饋抑制：選育抗結(jié)構(gòu)類似物的突變株，可以得到對對AK反饋抑制脫敏的菌株，代謝調(diào)節(jié)被遺傳性地解除，這是反饋抑制脫敏的菌株，代謝調(diào)節(jié)被遺傳性地解除，這是賴氨酸

32、發(fā)酵育種的重要手段。特別是選育營養(yǎng)缺陷型兼具結(jié)構(gòu)賴氨酸發(fā)酵育種的重要手段。特別是選育營養(yǎng)缺陷型兼具結(jié)構(gòu)類似物抗性的突變株，極有希望獲得高產(chǎn)菌株。表類似物抗性的突變株，極有希望獲得高產(chǎn)菌株。表4-8列舉了列舉了一些曾用過的結(jié)構(gòu)類似物，其中以一些曾用過的結(jié)構(gòu)類似物，其中以AEC效果佳、應(yīng)用廣。效果佳、應(yīng)用廣。 增加前體的生物合成：關(guān)鍵酶增加前體的生物合成：關(guān)鍵酶AK的催化反應(yīng)速度與底物的催化反應(yīng)速度與底物天門冬氨酸濃度的之間的關(guān)系呈天門冬氨酸濃度的之間的關(guān)系呈S型，隨著底物濃度的增加，型，隨著底物濃度的增加，AK與天門冬氨酸的親和協(xié)同性增大。根據(jù)變構(gòu)酶的與天門冬氨酸的親和協(xié)同性增大。根據(jù)變構(gòu)酶的S

33、型動力學(xué)特性，型動力學(xué)特性，為了提高賴氨酸的產(chǎn)量，應(yīng)設(shè)法增加前體物質(zhì)天門冬氨酸的濃度，為了提高賴氨酸的產(chǎn)量，應(yīng)設(shè)法增加前體物質(zhì)天門冬氨酸的濃度，以抵消變構(gòu)抑制劑的影響。因此可以考慮選育丙氨酸缺陷型，抗以抵消變構(gòu)抑制劑的影響。因此可以考慮選育丙氨酸缺陷型，抗天門冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株。天門冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株。 解除代謝互鎖：賴氨酸與亮氨酸的生物合成之間存在代謝解除代謝互鎖：賴氨酸與亮氨酸的生物合成之間存在代謝互鎖，因此可以考慮選育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的互鎖，因此可以考慮選育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株。突變株。 3、賴氨酸產(chǎn)生菌、賴氨酸產(chǎn)生菌FB42的獲得的獲得

34、在不含蘇氨酸的選擇性培養(yǎng)基上得到在不含蘇氨酸的選擇性培養(yǎng)基上得到50株蘇氨酸完全缺陷的株蘇氨酸完全缺陷的突變株，在抗性平板上得到突變株，在抗性平板上得到200株株LysHx抗性突變株，經(jīng)初篩、抗性突變株，經(jīng)初篩、復(fù)篩后得到復(fù)篩后得到FB41和和FB42。同出發(fā)株。同出發(fā)株FB31相比，產(chǎn)酸分別提高相比，產(chǎn)酸分別提高23%和和19%。誘變譜系見圖。誘變譜系見圖4-4。 4、FB42菌株對菌株對LysHx和和AHV的抗性檢驗的抗性檢驗 FB42（Leu-Thr-AECrAHVrLysHxr）是在添加）是在添加AHV和和LysHx的篩選平板上獲得的，因此具有對的篩選平板上獲得的，因此具有對AHV和和

35、LysHx的抗性，的抗性，在在LysHx為為4mg/L時，時，F(xiàn)B42的相對生長仍為的相對生長仍為80%，而此時，而此時FB31幾乎不生長；此外，幾乎不生長；此外，F(xiàn)B42對對AHV的抗性也有所增加。的抗性也有所增加。 5、FB41和和FB42的傳代實驗的傳代實驗 對對FB41（Leu-Thr-AECrAHVr）和）和FB42進(jìn)行反復(fù)傳代，進(jìn)行反復(fù)傳代，測定其賴氨酸合成能力。結(jié)果（表測定其賴氨酸合成能力。結(jié)果（表4-9）表明：）表明： FB42遺傳、發(fā)遺傳、發(fā)酵性能穩(wěn)定，是一株較好的賴氨酸產(chǎn)生菌，因此，進(jìn)一步對酵性能穩(wěn)定，是一株較好的賴氨酸產(chǎn)生菌，因此，進(jìn)一步對影響影響FB42產(chǎn)酸的環(huán)境因子和

36、發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。產(chǎn)酸的環(huán)境因子和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。 四、環(huán)境因子對四、環(huán)境因子對FB42分泌賴氨酸的影響分泌賴氨酸的影響 1、蘇氨酸和亮氨酸對產(chǎn)酸的影響、蘇氨酸和亮氨酸對產(chǎn)酸的影響 FB42為亮氨酸缺陷型和蘇氨酸需求型，所以發(fā)酵過程中必為亮氨酸缺陷型和蘇氨酸需求型，所以發(fā)酵過程中必須添加蘇氨酸和亮氨酸。須添加蘇氨酸和亮氨酸。 實驗結(jié)果表明，當(dāng)蘇氨酸濃度實驗結(jié)果表明，當(dāng)蘇氨酸濃度150mg/L時，就能滿足菌體時，就能滿足菌體生長的需求，且實驗范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)過高的蘇氨酸濃度對菌體生生長的需求，且實驗范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)過高的蘇氨酸濃度對菌體生長有抑制作用。對產(chǎn)酸而言，蘇氨酸濃度有一合適范圍長有抑制作用

37、。對產(chǎn)酸而言，蘇氨酸濃度有一合適范圍（100350mg/L之間），過高對之間），過高對FB42產(chǎn)賴氨酸有抑制作用。產(chǎn)賴氨酸有抑制作用。 FB42和和FB21菌株相比：菌體生長所需的賴氨酸濃度降低菌株相比：菌體生長所需的賴氨酸濃度降低了；蘇氨酸對產(chǎn)酸的抑制作用也有所減小。這是因為了；蘇氨酸對產(chǎn)酸的抑制作用也有所減小。這是因為:FB42為蘇氨酸需求型，其自身可合成少量的蘇氨酸，因而比蘇氨酸為蘇氨酸需求型，其自身可合成少量的蘇氨酸，因而比蘇氨酸缺陷型的缺陷型的FB21對蘇氨酸的需求少；對蘇氨酸的需求少；FB42對結(jié)構(gòu)類似物對結(jié)構(gòu)類似物AHV的的抗性較抗性較FB21有所增加，故而蘇氨酸對菌體賴氨酸合成

38、的抑制作有所增加，故而蘇氨酸對菌體賴氨酸合成的抑制作用得到緩解。用得到緩解。 亮氨酸對菌體生長和產(chǎn)酸的影響相似，即存在合適的生長亮氨酸對菌體生長和產(chǎn)酸的影響相似，即存在合適的生長和產(chǎn)酸濃度（和產(chǎn)酸濃度（400600mg/L），過高會抑制菌體生長和產(chǎn)酸。），過高會抑制菌體生長和產(chǎn)酸。 2、生物素濃度對產(chǎn)酸的影響、生物素濃度對產(chǎn)酸的影響 對于賴氨酸發(fā)酵，抑制谷氨酸的分泌可以使得代謝流轉(zhuǎn)向?qū)τ谫嚢彼岚l(fā)酵，抑制谷氨酸的分泌可以使得代謝流轉(zhuǎn)向賴氨酸的合成。谷氨酸是通過賴氨酸的合成。谷氨酸是通過Glu-Asp運輸系統(tǒng)向胞外運輸?shù)?，運輸系統(tǒng)向胞外運輸?shù)模撨\輸系統(tǒng)受細(xì)胞膜通透性的影響，細(xì)胞膜的通透性則受生物

39、該運輸系統(tǒng)受細(xì)胞膜通透性的影響，細(xì)胞膜的通透性則受生物素影響；而賴氨酸的分泌與素影響；而賴氨酸的分泌與Glu-Asp運輸系統(tǒng)無關(guān)，因此高生物運輸系統(tǒng)無關(guān)，因此高生物素濃度將抑制谷氨酸的分泌而應(yīng)該有利于賴氨酸分泌。通過合素濃度將抑制谷氨酸的分泌而應(yīng)該有利于賴氨酸分泌。通過合成培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵實驗表明，生物素濃度必須大于成培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵實驗表明，生物素濃度必須大于150g/L。發(fā)酵中，添加發(fā)酵中，添加3%的玉米漿即可滿足要求。的玉米漿即可滿足要求。 3、金屬離子對產(chǎn)酸的影響、金屬離子對產(chǎn)酸的影響 許多金屬離子都是微生物代謝途徑上酶的激活劑或是輔助許多金屬離子都是微生物代謝途徑上酶的激活劑或是輔助

40、因子。因子。 考察考察Mg、K、Fe、Mn、Cu的結(jié)果表明：的結(jié)果表明：K+和和Mg2+對產(chǎn)對產(chǎn)酸有促進(jìn)作用，合適的添加量為酸有促進(jìn)作用，合適的添加量為1g/L和和0.5g/L（以（以K2HPO4和和MgSO4.7H2O計）；計）； Fe2+和和Mn2+對產(chǎn)酸影響不大，而對產(chǎn)酸影響不大，而Cu2+對對產(chǎn)酸有抑制作用，尤其是當(dāng)產(chǎn)酸有抑制作用，尤其是當(dāng)Cu2+大于大于20mg/L時，幾乎不產(chǎn)賴時，幾乎不產(chǎn)賴氨酸。氨酸。 五、響應(yīng)面分析法優(yōu)化五、響應(yīng)面分析法優(yōu)化FB42菌株發(fā)酵培養(yǎng)基菌株發(fā)酵培養(yǎng)基 響應(yīng)面分析（響應(yīng)面分析（RSA）方法是數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，）方法是數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，以回

41、歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子實驗中，因子與以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子實驗中，因子與實驗結(jié)果的相互關(guān)系，用多項式近似，把因子與實驗結(jié)果實驗結(jié)果的相互關(guān)系，用多項式近似，把因子與實驗結(jié)果（響應(yīng)面）的關(guān)系函數(shù)化，依次對函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究（響應(yīng)面）的關(guān)系函數(shù)化，依次對函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化?；?通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成見通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成見P90。 第三節(jié)第三節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)中連續(xù)培養(yǎng)中FB42菌株的動力學(xué)特性及其代謝流分析菌株的動力學(xué)特性及其代謝

42、流分析 連續(xù)培養(yǎng)過程中各種條件相對穩(wěn)定，可以有目的、定量地連續(xù)培養(yǎng)過程中各種條件相對穩(wěn)定，可以有目的、定量地研究各種變量之間的相互關(guān)系，較為精確地求出一些發(fā)酵過程研究各種變量之間的相互關(guān)系，較為精確地求出一些發(fā)酵過程的重要動力學(xué)參數(shù)。這些動力學(xué)參數(shù)不依賴于培養(yǎng)條件，通常的重要動力學(xué)參數(shù)。這些動力學(xué)參數(shù)不依賴于培養(yǎng)條件，通常在分批發(fā)酵和流加發(fā)酵中很難得出。在分批發(fā)酵和流加發(fā)酵中很難得出。 就賴氨酸而言，由于缺乏發(fā)酵過程中一些重要的動力學(xué)參就賴氨酸而言，由于缺乏發(fā)酵過程中一些重要的動力學(xué)參數(shù)如基質(zhì)消耗比速、產(chǎn)物形成比速、菌體生長比速及其它們之?dāng)?shù)如基質(zhì)消耗比速、產(chǎn)物形成比速、菌體生長比速及其它們之間

43、的相互關(guān)系，因此很難對發(fā)酵過程進(jìn)行精確控制，不利于發(fā)間的相互關(guān)系，因此很難對發(fā)酵過程進(jìn)行精確控制，不利于發(fā)揮菌種的潛能。揮菌種的潛能。 菌種的潛能到底有多大，或菌種真實轉(zhuǎn)化率等于多大是需菌種的潛能到底有多大，或菌種真實轉(zhuǎn)化率等于多大是需要確定的值，該值是發(fā)酵過程優(yōu)化的目標(biāo)。要確定的值，該值是發(fā)酵過程優(yōu)化的目標(biāo)。 此外，發(fā)酵過程的理論轉(zhuǎn)化率也是一個重要的物理參數(shù)。此外，發(fā)酵過程的理論轉(zhuǎn)化率也是一個重要的物理參數(shù)。理論轉(zhuǎn)化率和真實轉(zhuǎn)化率是兩個不同的概念。理論轉(zhuǎn)化率代表理論轉(zhuǎn)化率和真實轉(zhuǎn)化率是兩個不同的概念。理論轉(zhuǎn)化率代表菌體最有效地利用外界物質(zhì)和能量而產(chǎn)生的效果，是熱力學(xué)意菌體最有效地利用外界物質(zhì)

44、和能量而產(chǎn)生的效果，是熱力學(xué)意義上的最大可能性，是一個確定的值；而真實轉(zhuǎn)化率則具有菌義上的最大可能性，是一個確定的值；而真實轉(zhuǎn)化率則具有菌體的特異性，根據(jù)兩者的差異可對菌株的代謝流進(jìn)行分析，用體的特異性，根據(jù)兩者的差異可對菌株的代謝流進(jìn)行分析，用以指導(dǎo)生產(chǎn)和菌株的改造。以指導(dǎo)生產(chǎn)和菌株的改造。 但是由于微生物代謝途徑的復(fù)雜性，而且理論轉(zhuǎn)化率往往但是由于微生物代謝途徑的復(fù)雜性，而且理論轉(zhuǎn)化率往往無法通過實驗直接得出，因此有關(guān)賴氨酸理論轉(zhuǎn)化率的報道眾無法通過實驗直接得出，因此有關(guān)賴氨酸理論轉(zhuǎn)化率的報道眾說紛紜，為此，陳堅等以連續(xù)培養(yǎng)方法為研究手段，進(jìn)行了更說紛紜，為此，陳堅等以連續(xù)培養(yǎng)方法為研究手

45、段，進(jìn)行了更加深入的研究。加深入的研究。 一、連續(xù)培養(yǎng)中的操作特性一、連續(xù)培養(yǎng)中的操作特性 由于營養(yǎng)缺陷型菌株，特別是基因工程菌，在連續(xù)傳代過由于營養(yǎng)缺陷型菌株，特別是基因工程菌，在連續(xù)傳代過程中存在著自然回復(fù)突變和質(zhì)粒脫落的現(xiàn)象，因此連續(xù)培養(yǎng)中程中存在著自然回復(fù)突變和質(zhì)粒脫落的現(xiàn)象，因此連續(xù)培養(yǎng)中的穩(wěn)態(tài)操作可分為兩個過程：開始的一段亞穩(wěn)態(tài)和回復(fù)突變后的穩(wěn)態(tài)操作可分為兩個過程：開始的一段亞穩(wěn)態(tài)和回復(fù)突變后達(dá)到的另一個最終穩(wěn)態(tài)點，為了能真實反應(yīng)菌體大量分泌賴氨達(dá)到的另一個最終穩(wěn)態(tài)點，為了能真實反應(yīng)菌體大量分泌賴氨酸的生長、代謝特性，只討論開始的一段亞穩(wěn)態(tài)。酸的生長、代謝特性，只討論開始的一段亞穩(wěn)

46、態(tài)。 1、菌體濃度、產(chǎn)物濃度、基質(zhì)濃度與稀釋率的關(guān)系、菌體濃度、產(chǎn)物濃度、基質(zhì)濃度與稀釋率的關(guān)系 如圖如圖4-14所示?？偟膩碚f，隨著稀釋率的增加，菌體濃度所示?？偟膩碚f，隨著稀釋率的增加，菌體濃度呈下降的趨勢，特別是當(dāng)呈下降的趨勢，特別是當(dāng)D0.15h-1后菌體濃度下降很快。在后菌體濃度下降很快。在D 0.15h-1時產(chǎn)物的濃度幾乎保持不變，但當(dāng)時產(chǎn)物的濃度幾乎保持不變，但當(dāng)D0.15h-1后，后，隨著菌體濃度的下降，產(chǎn)物濃度迅速下降。與隨著菌體濃度的下降，產(chǎn)物濃度迅速下降。與D= 0.05h-1時相時相比，比，D= 0.22h-1后時菌體濃度值下降了后時菌體濃度值下降了39%，產(chǎn)物濃度降低

47、了，產(chǎn)物濃度降低了52%，可見過高的稀釋率對產(chǎn)物的形成的負(fù)面影響更大。，可見過高的稀釋率對產(chǎn)物的形成的負(fù)面影響更大。 在在D 0.11h-1時，限制性基質(zhì)葡萄糖的濃度未檢出。其可時，限制性基質(zhì)葡萄糖的濃度未檢出。其可能的原因是：在較低的稀釋速率下，葡萄糖很快被轉(zhuǎn)化為代謝能的原因是：在較低的稀釋速率下，葡萄糖很快被轉(zhuǎn)化為代謝過程的中間產(chǎn)物，這時葡萄糖的限制作用可能由其代謝途徑上過程的中間產(chǎn)物，這時葡萄糖的限制作用可能由其代謝途徑上的某一中間產(chǎn)物表現(xiàn)出來。當(dāng)?shù)哪骋恢虚g產(chǎn)物表現(xiàn)出來。當(dāng)D 0.11h-1時，葡萄糖濃度開始時，葡萄糖濃度開始增加，當(dāng)增加，當(dāng)D= 0.22h-1時葡萄糖濃度急劇升高，此時

48、菌體濃度、時葡萄糖濃度急劇升高，此時菌體濃度、產(chǎn)物濃度的下降也很快，說明該點已接近洗出點。產(chǎn)物濃度的下降也很快，說明該點已接近洗出點。 2、產(chǎn)物生成比速、基質(zhì)消耗比速與稀釋率的變化關(guān)系、產(chǎn)物生成比速、基質(zhì)消耗比速與稀釋率的變化關(guān)系 如圖如圖4-15所示。產(chǎn)物生成比速（所示。產(chǎn)物生成比速（）與稀釋率之間存在著）與稀釋率之間存在著一個函數(shù)關(guān)系。當(dāng)一個函數(shù)關(guān)系。當(dāng)D 0.15h-1時，產(chǎn)物形成比速（時，產(chǎn)物形成比速（）隨）隨D增加增加呈線性增加；當(dāng)呈線性增加；當(dāng)D=0.15h-10.18h-1時，產(chǎn)物形成比速雖然繼續(xù)時，產(chǎn)物形成比速雖然繼續(xù)增加，但趨勢變得緩慢，產(chǎn)物形成比速的最大值出現(xiàn)在增加，但趨勢

49、變得緩慢，產(chǎn)物形成比速的最大值出現(xiàn)在D=0.18h-1附近，當(dāng)附近，當(dāng)D0.18h-1后，產(chǎn)物形成比速呈下降趨勢。后，產(chǎn)物形成比速呈下降趨勢。 葡萄糖的消耗比速（葡萄糖的消耗比速（）和產(chǎn)物形成比速有一對應(yīng)關(guān)系。）和產(chǎn)物形成比速有一對應(yīng)關(guān)系。在產(chǎn)物形成比速線性增加的區(qū)域內(nèi)，葡萄糖的消耗比速也呈線在產(chǎn)物形成比速線性增加的區(qū)域內(nèi)，葡萄糖的消耗比速也呈線性增加，當(dāng)產(chǎn)物形成比速呈下降趨勢后，葡萄糖消耗比速增加性增加，當(dāng)產(chǎn)物形成比速呈下降趨勢后，葡萄糖消耗比速增加的幅度變慢。這是因為葡萄糖不但用作菌體的生長，還用于產(chǎn)的幅度變慢。這是因為葡萄糖不但用作菌體的生長，還用于產(chǎn)物的形成。物的形成。 3、菌體和產(chǎn)物

50、表觀轉(zhuǎn)化率與稀釋率的變化關(guān)系、菌體和產(chǎn)物表觀轉(zhuǎn)化率與稀釋率的變化關(guān)系 如圖如圖4-16所示。所示。D=0.050.15h-1之間時，菌體的表觀轉(zhuǎn)化之間時，菌體的表觀轉(zhuǎn)化率率YX似有下降，當(dāng)似有下降，當(dāng)D進(jìn)一步增大時，菌體的表觀轉(zhuǎn)化率略有提進(jìn)一步增大時，菌體的表觀轉(zhuǎn)化率略有提高，但總的來說菌體的表觀轉(zhuǎn)化率隨稀釋率的變化不很明顯。高，但總的來說菌體的表觀轉(zhuǎn)化率隨稀釋率的變化不很明顯。 產(chǎn)物表觀轉(zhuǎn)化率產(chǎn)物表觀轉(zhuǎn)化率YP的變化和菌體表觀轉(zhuǎn)化率的變化呈相反的變化和菌體表觀轉(zhuǎn)化率的變化呈相反的趨勢。的趨勢。D從從0.05h-1增加到增加到0.15h-1時產(chǎn)物的表觀轉(zhuǎn)化率略有提時產(chǎn)物的表觀轉(zhuǎn)化率略有提高，高

51、，D 0.15h-1后產(chǎn)物的表觀轉(zhuǎn)化率大幅度下降。后產(chǎn)物的表觀轉(zhuǎn)化率大幅度下降。 造成產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率急劇下降的原因還不很清楚，但極有可能造成產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率急劇下降的原因還不很清楚，但極有可能是在很高的稀釋率下，菌體濃度和產(chǎn)物濃度很小，發(fā)酵液中培是在很高的稀釋率下，菌體濃度和產(chǎn)物濃度很小，發(fā)酵液中培養(yǎng)基的利用不很充分，這樣對產(chǎn)酸有抑制的物質(zhì)如蘇氨酸、亮養(yǎng)基的利用不很充分，這樣對產(chǎn)酸有抑制的物質(zhì)如蘇氨酸、亮氨酸的濃度相對較高，影響到賴氨酸的大量分泌。氨酸的濃度相對較高，影響到賴氨酸的大量分泌。 因此，對于產(chǎn)物的形成，稀釋率有一個較適的值。過高的因此，對于產(chǎn)物的形成，稀釋率有一個較適的值。過高的稀釋率對產(chǎn)物

52、的形成尤為不利。稀釋率對產(chǎn)物的形成尤為不利。 二、連續(xù)培養(yǎng)中賴氨酸發(fā)酵的動力學(xué)特性二、連續(xù)培養(yǎng)中賴氨酸發(fā)酵的動力學(xué)特性 1、菌體生長動力學(xué)、菌體生長動力學(xué) 盡管盡管Monod方程在應(yīng)用時會遇到多個限制生長因素，或高方程在應(yīng)用時會遇到多個限制生長因素，或高底物濃度抑制、或產(chǎn)物抑制、或多底物競爭、或多種微生物間底物濃度抑制、或產(chǎn)物抑制、或多底物競爭、或多種微生物間的競爭等許多問題，但在一般條件下，特別是產(chǎn)物抑制不明顯的競爭等許多問題，但在一般條件下，特別是產(chǎn)物抑制不明顯的連續(xù)培養(yǎng)中，的連續(xù)培養(yǎng)中，Monod方程表現(xiàn)出廣泛的適用性。方程表現(xiàn)出廣泛的適用性。 對于一個單級對于一個單級CSTR，有關(guān)菌體

53、（不計死亡）的物料衡算，有關(guān)菌體（不計死亡）的物料衡算式為：式為： V(dx/dt)=Fx0FxxV （4-2） 一般一般x0=0，所以式（，所以式（4-2）整理得：）整理得： dx/dt=(F/V) xx=(D) （4-3） 在連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時在連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時dx/dt=0，所以，所以=D。 依依Linrweaver-Burk方法對方法對Monod方程取倒數(shù)，得：方程取倒數(shù)，得： 1/ =(1/max)+(Ks/max).(1/s) （4-4） 將實驗數(shù)據(jù)做將實驗數(shù)據(jù)做1/s1/圖，結(jié)果見圖圖，結(jié)果見圖4-17，1/s與與1/呈線性呈線性關(guān)系。求得關(guān)系。求得max=0.24h-1，Ks

54、=0.88g/L。因此，。因此，F(xiàn)B42菌株在以菌株在以葡萄糖為基質(zhì)的連續(xù)培養(yǎng)生長動力學(xué)為：葡萄糖為基質(zhì)的連續(xù)培養(yǎng)生長動力學(xué)為： =0.24s/(0.88+s) （4-5） 由于半飽和常數(shù)由于半飽和常數(shù)Ks為為0.88g/L，表明葡萄糖濃度只在較低的，表明葡萄糖濃度只在較低的情況下才表現(xiàn)出限制菌體生長的作用，如果培養(yǎng)液中葡萄糖濃度情況下才表現(xiàn)出限制菌體生長的作用，如果培養(yǎng)液中葡萄糖濃度10g/L時，葡萄糖對菌體生長的限制作用可以不考慮。時，葡萄糖對菌體生長的限制作用可以不考慮。 2、產(chǎn)物形成動力學(xué)、產(chǎn)物形成動力學(xué) 產(chǎn)物形成過程非常復(fù)雜，為了便于研究，一般都將產(chǎn)物形成產(chǎn)物形成過程非常復(fù)雜，為了便

55、于研究，一般都將產(chǎn)物形成和菌體生長結(jié)合起來進(jìn)行討論，并將產(chǎn)物形成動力學(xué)建立成菌體和菌體生長結(jié)合起來進(jìn)行討論，并將產(chǎn)物形成動力學(xué)建立成菌體生長比速生長比速的函數(shù)。如圖的函數(shù)。如圖4-18所示。所示。 從圖從圖4-18知道，知道，和和的關(guān)系不是線性關(guān)系，用一個二次曲線的關(guān)系不是線性關(guān)系，用一個二次曲線進(jìn)行擬合，得到產(chǎn)物形成的動力學(xué)表達(dá)式為：進(jìn)行擬合，得到產(chǎn)物形成的動力學(xué)表達(dá)式為： = 0.03161.2573.092 （4-6） 從圖從圖4-18知道，當(dāng)知道，當(dāng)0.16h1時，時，和和幾乎呈線性關(guān)系。幾乎呈線性關(guān)系。 = 0.57 （4-7） 從式（從式（4-7）可以看出，在較低的稀釋率下，產(chǎn)物的

56、形成表）可以看出，在較低的稀釋率下，產(chǎn)物的形成表現(xiàn)為生長偶聯(lián)。盡管普遍的觀點均認(rèn)為賴氨酸為現(xiàn)為生長偶聯(lián)。盡管普遍的觀點均認(rèn)為賴氨酸為類發(fā)酵，產(chǎn)類發(fā)酵，產(chǎn)物的形成為生長部分偶聯(lián)，但前面的研究結(jié)果表明，在某些特物的形成為生長部分偶聯(lián)，但前面的研究結(jié)果表明，在某些特定的條件下，賴氨酸的產(chǎn)物形成會表現(xiàn)出生長偶聯(lián)型的特征。定的條件下，賴氨酸的產(chǎn)物形成會表現(xiàn)出生長偶聯(lián)型的特征。 三、三、FB42的真實轉(zhuǎn)化率的真實轉(zhuǎn)化率P94 假定碳源主要由葡萄糖提供，其它成分所提供的碳源和葡假定碳源主要由葡萄糖提供，其它成分所提供的碳源和葡萄糖相比可忽略不計。這樣穩(wěn)態(tài)操作中碳源的物料平衡式為：萄糖相比可忽略不計。這樣穩(wěn)態(tài)

57、操作中碳源的物料平衡式為： D(Cg1Cg0)DCX/YX+DCP/YP+mCX （4-8） 若真實轉(zhuǎn)化率若真實轉(zhuǎn)化率YX、YP和維持消耗常數(shù)和維持消耗常數(shù)m在各穩(wěn)態(tài)操作中保在各穩(wěn)態(tài)操作中保持不變，則式（持不變，則式（4-8）可轉(zhuǎn)化為如下的線性等式：）可轉(zhuǎn)化為如下的線性等式： 1/Y0=(1/YP)+CX/(CPYX )+mCX/(DCP) （4-9） Y0為產(chǎn)物對葡萄糖的表觀轉(zhuǎn)化率。為產(chǎn)物對葡萄糖的表觀轉(zhuǎn)化率。 由式（由式（4-9）可知，在一個三維空間作）可知，在一個三維空間作1/Y0關(guān)于關(guān)于CX/CP與與CX/DCP的圖（圖的圖（圖4-19），能求出真實轉(zhuǎn)化率與維持消耗常數(shù)），能求出真實轉(zhuǎn)

58、化率與維持消耗常數(shù)的值。事實上由于在的值。事實上由于在D適中的條件下建立穩(wěn)態(tài)時，適中的條件下建立穩(wěn)態(tài)時，m很小，很小，這一點從圖這一點從圖4-19中可以直觀地看出，所以式（中可以直觀地看出，所以式（4-9）可以近似）可以近似為：為： 1/Y0=1/YP+CX/(CPYX) （4-10） 將實驗數(shù)據(jù)作如圖將實驗數(shù)據(jù)作如圖4-20所示的所示的1/Y0 CX/CP圖，可以看出圖，可以看出1/Y0與與CX/CP呈很明顯的線性關(guān)系，經(jīng)回歸可得呈很明顯的線性關(guān)系，經(jīng)回歸可得: 1/Y0=1.466+1.771(CX/CP) （4-11） 相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)R=0.97 計算得到菌體和產(chǎn)物的真實轉(zhuǎn)化率分別為計

59、算得到菌體和產(chǎn)物的真實轉(zhuǎn)化率分別為0.56g/g與與0.68g/g。 由于培養(yǎng)基中除葡萄糖外尚有玉米漿和幾種必須氨基酸提由于培養(yǎng)基中除葡萄糖外尚有玉米漿和幾種必須氨基酸提供部分碳源，共可折算成供部分碳源，共可折算成2g/L的葡萄糖，這樣對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行的葡萄糖，這樣對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行修正，得到：菌體的真實轉(zhuǎn)化率修正，得到：菌體的真實轉(zhuǎn)化率(YX)為為0.51g/g；產(chǎn)物的真實轉(zhuǎn)；產(chǎn)物的真實轉(zhuǎn)化率（化率（YP）為）為0.62g/g（產(chǎn)物以賴氨酸鹽酸鹽計產(chǎn)物以賴氨酸鹽酸鹽計）。）。 四、賴氨酸發(fā)酵的最大理論轉(zhuǎn)化率四、賴氨酸發(fā)酵的最大理論轉(zhuǎn)化率 文獻(xiàn)中發(fā)表的賴氨酸發(fā)酵的定量反應(yīng)方程式如下：文獻(xiàn)中發(fā)表的賴氨

60、酸發(fā)酵的定量反應(yīng)方程式如下： 2C6H12O6+2NH3+5O2C6H14N2+8H2O+6CO2 (4-12) 3C6H12O6+4NH3+4O22C6H14N2+10H2O+6CO2 (4-13) 4C6H12O6+6NH3+3O23C6H14N2+12H2O+6CO2 (4-14) 1.18C6H12O6+2NH3+0.08O2C6H14N2+3.08H2O+1.08CO2 (4-12) 賴氨酸合成的中間產(chǎn)物草酰乙酸可由賴氨酸合成的中間產(chǎn)物草酰乙酸可由TCA循環(huán)或磷循環(huán)或磷酸烯醇式丙酮酸（酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化途徑獲得。當(dāng)草酰乙酸通）羧化途徑獲得。當(dāng)草酰乙酸通過過TCA循環(huán)合成時，