基質(zhì)金屬蛋白酶在牙周病變中的研究進(jìn)展

1、基質(zhì)金屬蛋白酶在牙周病變中的研究進(jìn)展劉宇， 口腔醫(yī)學(xué)1101， zjuliuyu69 摘 要：牙周病是威脅人類(lèi)口腔健康的重要疾病之一?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)作為降解膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類(lèi),對(duì)牙周組織的破壞起著至關(guān)重要的作用。目前,人們已認(rèn)識(shí)到 MMPs 在牙齦炎癥中具有重要的作用, 對(duì)MMPs的研究有利于控制牙周病的發(fā)生和發(fā)展。 關(guān)健詞：基質(zhì)金屬蛋白酶，牙周病變，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑牙周病(periodontal disease)是發(fā)生在牙支持組織的慢性細(xì)菌感染性疾病，包括牙齦炎和牙周炎，主要癥狀為牙齦炎癥和出血、牙周袋形成、牙

2、槽骨吸收、牙齒松動(dòng)和移位等。第三次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查表明,我國(guó)成年人中約 80%-97%患有不同程度的牙周疾病1。牙周病也已成為成年人牙齒喪失的首要原因2。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn) MMPs 及其抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)是牙周病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用的蛋白水解酶。牙周炎的重要病理過(guò)程是牙周細(xì)胞外基質(zhì)( extracellular matrix, ECM) 的降解,ECM 構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境,膠原占據(jù)其主體。MMPs 與 ECM 中膠原、蛋白多糖等代謝關(guān)系密切,在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。本文就近年來(lái) MM

3、Ps 在牙周病變研究中的進(jìn)展總結(jié)如下。1 MMPs概述 基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一類(lèi)生物活性依賴(lài)于鈣離子和鋅離子的內(nèi)肽酶家族,具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力3。1962 年,Gross 與 Lapiere 最先于蝌蚪中發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)金屬蛋白酶家族的第一位成員膠原酶4。到目前為止,人類(lèi)研究已發(fā)現(xiàn)25種MMPs, 分為五類(lèi)。1.1 MMPs結(jié)構(gòu)大多數(shù) MMPs 具有不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)5,但所有 MMPs 的結(jié)構(gòu)都是在 5 個(gè)結(jié)構(gòu)域(信號(hào)肽區(qū)、前肽區(qū)、催化結(jié)構(gòu)區(qū)、纖維連接素樣區(qū)和血結(jié)合素樣區(qū))的基礎(chǔ)上增加或減少而成6(圖-1)。經(jīng)典的MMP結(jié)構(gòu)需含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別為前肽結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。前肽結(jié)構(gòu)域由大

4、約80個(gè)氨基酸組成,存在一個(gè)高度保守的氨基酸序列:PRCGV(N)PD,其中的半胱氨酸對(duì)酶原形式的維持起重要作用。在酶原的激活過(guò)程中，這個(gè)結(jié)構(gòu)域就會(huì)被水解掉。在所有 MMPs的催化結(jié)構(gòu)域中都含有一段十分保守的氨基酸序列：HEXGHXXGXXH，其中的三個(gè)組氨酸可以與酶活性中心Zn2+結(jié)合而形成配位鍵，從而對(duì)酶的催化活性起重要作用7。除了MMP-7、-26外,其他MMPs在碳末端還含有一個(gè)血結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域，它被認(rèn)為可以介導(dǎo)MMPs抑制劑與酶的互作及與細(xì)胞受體間的聯(lián)系。1.2 MMPs分類(lèi)基于底物特異性、序列相似程度及結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成情況，大多學(xué)者將 MMPs 分為五類(lèi)：膠原酶、明膠酶、基質(zhì)水解酶類(lèi)、

5、模型-MMPs(MT-MMP)及其他 MMPs8。每一類(lèi) MMPs中包含多種生理病理特性不同的酶，總結(jié)于表-1中。圖-1. MMP結(jié)構(gòu)示意圖表-1. 基質(zhì)金屬蛋白酶家族（只包含主要胞外基質(zhì)底物）MMPs 分類(lèi)編號(hào)分子量（kd ）水解底物膠原酶間質(zhì)膠原酶MMP-155/45COL-I, II, III, IV, V, 噬中性細(xì)胞膠原酶MMP-875/58VII , VIII , X, XI,膠原酶-3MMP -1360/48FN, GL, PLP, PGs, TN,爪蟾屬膠原酶（膠原酶-4）MMP-1855/?pro -MMP-2, -9 明膠酶明膠酶-AMMP-272/66GL, COL-I,

6、 IV, V, VII, X, XI, XIV, EL, FN, LN, PLP, PGs, VN, 明膠酶-BMMP-992/86pro-MMP-9, -13基質(zhì)水解酶基質(zhì)水解酶-1MMP-357/45COL-II, III, IV, V, IX, X, XI, EL,基質(zhì)水解酶-2MMP -1057/44FN, GL, LN, PLP, PGs, TN, VN,基質(zhì)水解酶-4MMP -1151/44Pro-MMP-1, -7, -8, -9, -13MMP -19?/?釉質(zhì)水解酶（enamelysin）MMP-20?/?牙釉蛋白金屬?gòu)椥缘鞍酌窶MP-1254/45/22EL, COL-IV

7、, GL, FN, VN, LN, PG模型MMPsMT1-MMPMMP-1466/56Pro-MMP-2, -13,MT2-MMPMMP-1572/?COL-I, II, III, EL, FN, GL, LN,MT3-MMPMMP-1664/52PGs, TN, VNMT4-MMPMMP-17?/?其他MMPs基質(zhì)分解素MMP-728/19COL-IV, X, EL, FN, GL, LN, PGs, PLP, TN, VN, pro-MMP-1, -2, -9其中幾種主要基質(zhì)金屬蛋白酶的作用范圍如下9-10(表-2):表-2 幾種MMP生理學(xué)功能名稱(chēng)來(lái)源生理學(xué)功能口腔疾病中生理學(xué)作用MM

8、P-1正常情況下存在于機(jī)體牙齦上皮細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞及牙槽骨邊緣細(xì)胞創(chuàng)傷愈合角化細(xì)胞遷移、上皮再生血小板聚集細(xì)胞遷移細(xì)胞增殖在局限型侵襲性牙周炎中誘導(dǎo)膠原降解MMP-8中性粒細(xì)胞合成,同時(shí)也存在于牙本質(zhì)細(xì)胞中在牙周組織退化中發(fā)揮中心作用抗炎對(duì)齲病、牙周病起到一定的誘導(dǎo)作用MMP-13纖維母細(xì)胞抗炎破骨細(xì)胞活化釋放bFGF參與牙周病的形成,但其對(duì)牙周組織的破壞機(jī)制尚不統(tǒng)一2 MMPs 的調(diào)節(jié)MMPs在體內(nèi)的表達(dá)、激活以及對(duì)底物的分解過(guò)程都受到嚴(yán)格的調(diào)控。MMPs 在體內(nèi)以活化和非活化兩種狀態(tài)存在，兩者之間需要精確的調(diào)節(jié)作用。正常情況下,機(jī)體分泌MMPs的量較少，機(jī)體處于正常的運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體

9、出現(xiàn)某些異常情況時(shí),這種信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞，在細(xì)胞上轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且合成分泌MMPs,使MMPs的量超過(guò)正常范圍。反之酶的合成和分泌則停止，MMPs再次失去活性。如同其他蛋白質(zhì)一樣,這種調(diào)控可通過(guò)以下幾個(gè)不同水平實(shí)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控;轉(zhuǎn)錄后 mRNA 穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的翻譯與酶原分泌的調(diào)控;酶原激活的調(diào)控以及激活后抑制劑對(duì)其活性的調(diào)控。值得注意的是,ECM被MMPs降解后形成的碎片可以加強(qiáng)MMPs的表達(dá)12。在胞外環(huán)境中,抑制劑和活化調(diào)節(jié)等因素也會(huì)影響MMPs的活性。2.1 轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控 在轉(zhuǎn)錄水平上,有生長(zhǎng)因子、激素或其他化學(xué)物質(zhì)參與調(diào)節(jié)。被廣泛研究的兩個(gè)因子為白介素-1(IL-1

10、)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(TGF-)。IL-可以促進(jìn) MMPs的表達(dá), 而TGF-在多數(shù)細(xì)胞中則抑制其基因的表達(dá)11。2.2 酶原活化的調(diào)節(jié)MMPs 既可以被體內(nèi)存在的天然激活劑激活,也可以在體外被特定的化學(xué)物質(zhì)所激活。另外有些MMPs也可激活其他的MMPs。關(guān)于MMPs激活的機(jī)制目前尚未明晰,但比較公認(rèn)的學(xué)說(shuō)是“半胱氨酸開(kāi)關(guān)”學(xué)說(shuō)。 該學(xué)說(shuō)13認(rèn)為當(dāng) MMPs 以酶原的形式存在時(shí),活性中心 Zn2+除了與催化結(jié)構(gòu)域保守序列中的三個(gè)組氨酸形成配位鍵外，還與前肽結(jié)構(gòu)域保守序列中的半胱氨酸形成一個(gè)配位鍵, 此時(shí)酶的活性中心被覆蓋，因而沒(méi)有催化活性。激活劑可以使酶的活性中心暴露，從而使 MMPs發(fā)揮作用。

11、機(jī)制為：（1）某些激活劑可直接打斷半胱氨酸-Zn2+之間的配位鍵,一個(gè)水分子得以進(jìn)入并取代半胱氨酸,從而使酶的活性中心暴露,底物進(jìn)入該疏水區(qū)域而被催化降解；（2）有些激活劑可以將前肽段去除,半胱氨酸- Zn2+打開(kāi),使酶活性中心暴露而激活；（3）另外，有些激活劑還能從MMPs的羧基末端水解掉一個(gè)小肽段,從而使其進(jìn)一步被激活而形成分子質(zhì)量更小的超活性形式。（4）某些激活劑可以改變MMPs的空間構(gòu)象,使其發(fā)生某種程度的扭曲,當(dāng)扭曲產(chǎn)生的張力大于打開(kāi)半胱氨酸-Zn2+的鍵能時(shí), 半胱氨酸-Zn2+打開(kāi)而MMPs被激活。2.3 活化后調(diào)節(jié)MMPs 可被廣譜的血漿抑制劑2-巨球蛋白(2-M)所抑制,更為

12、重要的是,可為T(mén)IMPs所抑制14-16。目前,在脊椎動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn) 4 種 TIMP(表-3)。表-3 MMPs抑制劑（TIMP）家族蛋白質(zhì)分子量（kd）TIMP-128.5（糖蛋白）TIMP-221（非糖化蛋白）TIMP-327（糖蛋白）24（非糖化蛋白）TIMP-423（非糖化蛋白）TIMP可與激活以后的MMPs 11 結(jié)合，形成高親和力、非共價(jià)的復(fù)合物，從而抑制 MMPs 活性。并且，TIMP 可以與 MMPs 的前肽形式相作用14，阻止或延緩MMPs由酶原轉(zhuǎn)換為激活狀態(tài)。TIMP 的表達(dá)可被眾多的因素所調(diào)節(jié)。許多與細(xì)胞生長(zhǎng)和功能相關(guān)的因子也可以促 進(jìn) TIMP 的表達(dá)，包括IL-1、I

13、L-6、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、TGF-、腫瘤壞死因子-(Tumor Necrosis Factor-, TNF-)等。有趣的是,這其中很多因子也參與MMPs和基質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)。這些因子的基因包含相同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域,提示它們可能具有相同的調(diào)控機(jī)制14。3 MMPs與牙周病變的關(guān)系 在齦溝處，膠原是胞外的主要成分。細(xì)菌所致牙周炎癥最終會(huì)導(dǎo)致牙周附著喪失和骨的破壞。研究已證明在活動(dòng)期牙周炎中,MMPs 在牙齦組織的破壞過(guò)程中發(fā)揮了作用17。 3.1 MMPs在牙周病變中的作用機(jī)制用多克隆抗體,借助親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在牙周炎病人結(jié)合上皮的結(jié)締組

14、織中可以檢測(cè)到被膠原酶水解的I型膠原酶片段,證明膠原酶存在于牙周炎病人結(jié)合上皮的結(jié)締組織中18。作為PMN蛋白的一種，乳鐵蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn) MMPs。因此在齦溝液中也可以檢測(cè)到活化的MMPs或未活化的MMPs。宿主細(xì)胞來(lái)源的膠原酶參與牙周組織的降解、附著喪失。如前文所述，MMPs酶原激活有一系列的機(jī)制,未活化的MMPs暴露活性中心后即成為活化的 MMPs，從而將膠原分解為兩個(gè)片段(3/4 片段的羧基端,1/4 片段的氨基端), 破壞牙周結(jié)締組織19-21。正常情況下,膠原酶主要由中性粒細(xì)胞分泌。在牙周炎中,致病菌會(huì)刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)降解酶。與此同時(shí),這些細(xì)胞還能產(chǎn)生纖維蛋白溶

15、解酶原激活物,將纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)化成為纖維蛋白酶,繼而激活潛在形式的基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)22。3.2 MMPs與牙槽骨吸收在牙周疾病中,骨的破壞是十分重要的標(biāo)志。但 MMPs 在牙周骨吸收中的作用還未完全闡明。當(dāng)前,關(guān)于MMPs的基礎(chǔ)研究成果為我們了解其在牙周骨吸收中的作用提供了很好的借鑒。破骨細(xì)胞的表達(dá),連同組織蛋白酶K和一些 MMPs 在骨吸收中發(fā)揮了重要的作用23-24。在骨吸收的過(guò)程中,抑制 MMPs 可以阻止細(xì)胞遷移25-26，提示MMPs在破骨細(xì)胞到達(dá)吸收部位的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并且MMP-9 和 MMP-14可能是此過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶23,27。MMP-14 定位于破骨

16、細(xì)胞的細(xì)胞皺褶，可能促進(jìn)破骨細(xì)胞與骨的附著及分離,從而與基質(zhì)發(fā)生相互作用28。 除此之外，MMP 還可能通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的招募和活動(dòng)從而參與到骨吸收過(guò)程中。這些活動(dòng)包括從骨基質(zhì)中釋放細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(如MMP-9調(diào)節(jié)TGF-),調(diào)節(jié)信使與受體的結(jié)合等23。總的來(lái)說(shuō)，骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞不僅依賴(lài)MMPs對(duì)骨基質(zhì)成分的直接降解，而且需要MMPs參與介導(dǎo)成骨細(xì)胞對(duì)成熟破骨細(xì)胞的活化以及破骨細(xì)胞的遷移、貼附過(guò)程。3.3 MMPs與牙周炎癥牙齦結(jié)締組織中的主要細(xì)胞為成纖維細(xì)胞,它同時(shí)也是牙周組織改建的主要修復(fù)細(xì)胞之一。成纖維細(xì)胞通過(guò)遷移、增殖、分泌膠原等對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)起作用36。正常情況下, 牙齦成纖維細(xì)胞能

17、合成、分泌少量有活性的膠原酶及其它金屬蛋白酶,產(chǎn)生并維持細(xì)胞外基質(zhì),但在炎癥狀況下則增加合成及分泌MMPs并產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活物。將纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶,而活化“潛在形式”的膠原酶和其它金屬蛋白酶。 基質(zhì)金屬蛋白酶直接參與牙周組織的破壞降解過(guò)程,在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。最近的研究顯示明膠酶(MMP-2,-9)和所有的膠原酶都與牙周炎相關(guān)29-33。Mäkelä 等研究顯示MMP-2和MMP-9可以參與到牙周炎的組織破壞中。他們?cè)诳谇恢卸ㄎ涣瞬煌瑏?lái)源的明膠酶產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在牙周病中明膠酶的含量上升，并且經(jīng)過(guò)治療后，這些酶的含量明顯降低。此結(jié)論在體內(nèi)試驗(yàn)中

18、亦得到了證明34。通過(guò)縱向隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，膠原酶隨時(shí)間而顯著上升的現(xiàn)象只發(fā)生于牙周破壞的進(jìn)程中。4 MMPs與牙周病的診斷MMP-8 在牙周病中的重要作用逐漸為人們所關(guān)注。在牙周炎中,MMP-8 水平是評(píng)估疾病和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。目前,已有 MMP-8 的臨床檢查方法。它利用免疫學(xué)原理,通過(guò)深刮實(shí)驗(yàn)即可實(shí)行,臨床牙醫(yī)不需要特殊的儀器就可以在5分鐘內(nèi)獲得結(jié)果33,35。 MMPs不僅是炎癥進(jìn)展過(guò)程中的指示因子，同樣也影響著宿主反應(yīng)。因而 MMPs 的水平不能單單解讀為組織退化，也顯示了炎癥水平(保護(hù)與破壞的平衡)。5 MMPs與牙周病的治療綜上所述,MMPs 對(duì)牙周病的發(fā)生、發(fā)展具有一定的促進(jìn)作

19、用。因而,牙周病的治療關(guān)注于研究抑制 MMPs 的活性,從而終止其對(duì)牙周組織的破壞作用。 金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase inhibitors, MMPI)是研究的重點(diǎn),它可以分為兩大類(lèi),分別為天然抑制劑和人工化學(xué)合成抑制劑。在牙周病中,TIMP的含量不足以通過(guò)提高M(jìn)MPs 的含量來(lái)減少組織破壞，但一些研究證明通過(guò)MMPs人工抑制劑可以控制牙周組織的破壞38。因此人們著力于研究開(kāi)發(fā)人工合成抑制劑，以期其在牙周病的治療領(lǐng)域中發(fā)揮作用。目前已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)的人工合成抑制劑有 Marimastat, A93340, Bayl2-9566等。有限的生物利用度和酶選

20、擇性的缺乏限制著MMPIs的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)的抑制劑將著重解決這些問(wèn)題37。參考文獻(xiàn)1 Fire A, Xu S Q, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegansJ. nature, 1998, 391(6669): 806-811. 2 Grivna S T, Beyret E, Wang Z, et al. A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic c

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