基因文庫的構(gòu)建

1、主要內(nèi)容 第一節(jié) DNA基因文庫 第二節(jié) 亞克隆 第三節(jié) 克隆DNA序列的體外誘變 第四節(jié) 基因編碼序列的丙氨酸掃描誘變1DNADNA片段片段的獲得的獲得載體構(gòu)建載體構(gòu)建細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化重組體重組體的鑒定的鑒定限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶消化切酶消化機(jī)械切割機(jī)械切割雙鏈雙鏈cDNA的合成的合成化學(xué)法化學(xué)法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端連接連接平末端平末端連接連接加接頭造成加接頭造成粘性末端粘性末端重組噬菌體重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體外包裝體外包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)表型鑒定表型鑒定核酸雜交核酸雜交免疫學(xué)分析免疫學(xué)分析酶切鑒定酶切鑒定大腸桿菌作為寄主進(jìn)行DN

2、A克隆的實(shí)驗(yàn)方案2Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylin

3、ker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHOHOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA

4、concatemers+Packaging in vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用載體EMBL3A構(gòu)建基因組文庫3第一節(jié) DNA基因文庫 用限制性內(nèi)切酶酶切整個(gè)基因組DNA，把所得到的大量基因組DNA片段與載體連接，然后轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中去，讓宿主菌長(zhǎng)成克隆。是某個(gè)生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。 cDNA文庫：某個(gè)特定物種或器官的所有mRNA的組合。 建立DNA文庫的目的：從復(fù)雜的基因組中分離基因。4二、 DNA文庫的構(gòu)建（一）、基因組DNA庫1、 用克隆載體構(gòu)建基因組文庫Question 1

5、：構(gòu)建含多少重組子的庫能覆蓋一個(gè)選定的基因組？考慮兩個(gè)因素：載體的裝載能力 目標(biāo)基因組的大小目標(biāo)基因組的大小載體裝載的平均片段重組子的個(gè)數(shù)5（一）、基因組DNA庫Question2：如何保證目標(biāo)基因包含在所構(gòu)建的文庫中？考慮兩個(gè)實(shí)際問題： 選擇的載體裝載量 所用的內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA的完全切割頻率和不完全切割二、 DNA文庫的構(gòu)建6人類基因組2.8X106Kb置換載體的平均置換片段20Kb重組子的最小數(shù)目n1.4X105 考慮取樣，酶切等原因，某些基因可能有多個(gè)重組子，而某些基因完全不包含。通過概率的統(tǒng)計(jì)，人類基因組中某個(gè)特異的片段有95概率包含所需要的重組子為 n4.2X105二、 DNA文

6、庫的構(gòu)建72、高容量載體構(gòu)建基因組克隆 優(yōu)點(diǎn)：A、所需要的重組子少（即文庫中包含的克隆數(shù)目較少）。B、目標(biāo)基因相對(duì)比較完整。二、 DNA文庫的構(gòu)建8第二節(jié) 亞克隆 概念：對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)程重新克隆，目的是對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或進(jìn)行重組改造等。 過程：1）目的DNA片段和載體制備；2）目的DNA片段與載體相連；3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；4)重組子的篩選9第二節(jié) 亞克隆 對(duì)大片段的插入片段進(jìn)行亞克隆的過程1）首先確定該大片的限制酶酶切圖譜2）根據(jù)已知的酶譜進(jìn)行定向克隆3）或鳥槍法進(jìn)行隨機(jī)克隆10通過作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的不同限制性位點(diǎn)。以DNA為例1112按照誘變產(chǎn)生的不同效果分

7、類： 隨機(jī)誘變：在克隆化的基因序列中隨機(jī)產(chǎn)生各種誘變。 化學(xué)誘變、盒式誘變、隨機(jī)缺失誘變等 定點(diǎn)誘變：體外特異地改變目的DNA序列中某個(gè)堿基的技術(shù)稱為定點(diǎn)誘變 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、寡核苷酸介導(dǎo)的誘變（如kunkel法）第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變13第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變一、缺失誘變1、通過從末端或中間刪除一些核苷酸序列末端刪除部分序列 14末端標(biāo)記外切酶III處理SI核酸酶處理Klenow 酶，連接酶處理15一、缺失誘變 2、通過酶切圖譜完成中間缺失16二、盒式突變1、原理：利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相應(yīng)序列。2、人工合成的突變序列的特征

8、 由兩條合成的寡核苷酸組成的,當(dāng)它們退火時(shí),會(huì)按設(shè)計(jì)要求產(chǎn)生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在異源雙鏈的中間體,因此重組質(zhì)粒全部是突變體。第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變17盒式突變舉例1AAGCTTtargetGAATTCTTCGAAtargetCTTAAGHindIIIEco RIA AATTCTTTCGA GAGCTTTAAAGCTTTAAMelt and anneal oligosT4 polynucleotide kinaseGel purify vector DNAMutagenic oligonucleotidesT4 DNA ligaseTransformed into E c

9、oli 優(yōu)點(diǎn)：快速高效無異源雙鏈的形成無需DNA聚合酶缺點(diǎn):需要在目標(biāo)序列的兩側(cè)具有限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)18AGCTGTACXho ISph ICCArg GluIle*Glu Met*Glu AlaVal Ser MetTCGA GAA ATC NNGGAG ATG NNGGAAGCGGTTAGC ATGCTT TAGIIICTC TACIIICTTCGCCAATC盒式突變舉例2利用混雜寡聚核苷酸方法的隨機(jī)突變19第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變?nèi)?、定點(diǎn)誘變的PCR方法20三、定點(diǎn)誘變的PCR方法 根據(jù)靶DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)的內(nèi)側(cè)引物c和b(c和b互補(bǔ))，他們?cè)谙嗤奈稽c(diǎn)具有同樣的堿基突變；

10、 分別以左側(cè)引物ac和右側(cè)引物bd進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增； 除去未參入的多余引物，由于具有重疊序列，故經(jīng)變性和退火形成異源雙鏈分子 其中只有具3凹陷末端的雙鏈分子可通過TaqDNA聚合酶的及外側(cè)引物a和d的作用下，形成其突變位點(diǎn)是位于靶DNA序列中但遠(yuǎn)離兩端的突變體。第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變21四、引物延伸：?jiǎn)我锓ǎú灰蕾嘝CR反應(yīng)）1、原理利用一段人工合成的，與互補(bǔ)的序列有一個(gè)堿基錯(cuò)配的寡核苷酸片段（720堿基）, 并由該寡核苷酸引導(dǎo)DNA的體外合成。第三節(jié)：克隆DNA序列的體外誘變22AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemical

11、ly synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Isolate mutantTransformed E coliWild-typeMutantAnneal(1) 正鏈DNA的合成 按照體外DNA重組技術(shù),將待

12、突變的DNA片段插入到M13噬菌體上. 然后制備含有目的基因的M13 單鏈DNA,即”正鏈”DNA.(2) 突變引物的合成 應(yīng)用化學(xué)方法合成帶錯(cuò)配堿基的誘變劑寡核苷酸片段,它在以單鏈M13DNA作模板的體外DNA合成中是作為引物使用,所以叫做突變引物序列,或”負(fù)鏈” DNA23(3) 異源雙鏈DNA的制備 將突變引物DNA5端磷酸化后,與含目的基因的M13單鏈DNA混合退火. 結(jié)果在待誘變的核苷酸部位及其附近形成一小段具堿基錯(cuò)配的異源雙鏈DNA。在Klenow酶的催化下，引物鏈以M13單鏈DNA為模板，直至合成出全長(zhǎng)的互補(bǔ)鏈。再由T4DNA連接酶連接，最終在體外合成出閉環(huán)的異源雙鏈M13DNA

13、分子。AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemically synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Isolate mutantTransformed E

14、 coliWild-typeMutantAnneal24AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemically synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Is

15、olate mutantTransformed E coliWild-typeMutantAnneal(4) 轉(zhuǎn)化 這些體外合成的閉環(huán)異源雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后，產(chǎn)生出同源雙鏈DNA分子。其中有的是原來野生型DNA序列，有的是含突變堿基的序列，因此，轉(zhuǎn)化子細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生兩種類型的噬菌體，一種是野生型的，另一種是突變型的。(5) 突變體的篩選2555Primer CPrimer B55Primer APrimer A55PCRPCRPCRPCR33Mix,denature and annealDNA plotmerase3355+3+3PCR with primer B and prime

16、r C(a)(b)(c)(d)Primer APrimer A26五、寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變1背景介紹（ Kunkel 法）dut-dUTP 酶缺陷，細(xì)胞不能把 dUTP 轉(zhuǎn)化為 dUMP ，因此細(xì)胞內(nèi) dUTP 的含量大為增加，其中一些 dUTP 可摻入 DNA 中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置。ung -UDG 酶缺陷， UDG 酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去摻入 DNA 中的尿嘧啶殘基。 27（五）寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變28 Kunkel 法原理，過程包括： 當(dāng)含目標(biāo) DNA 插入載體并進(jìn)入 E.coli CJ236 由于該菌體 ung- dut-

17、 突變，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。 M13K07 輔助感染下，產(chǎn)生帶 U 的單鏈 DNA 。 與引入誘變的引物復(fù)性。29 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以帶 U 的單鏈 DNA 為模板合成一條新鏈，形成雜合雙鏈（新生鏈中無U堿基）。 感染 dut+ ung+ E.coliMV1190 后，在細(xì)胞分裂過程中，只有新合成的 DNA 鏈才能起模板作用合成新的并引入了誘變位點(diǎn)的子代雙鏈 DNA 。而有 U 的 DNA 鏈，在 dut+ 和 ung+ 產(chǎn)物的作用下，尿嘧啶被水解，從而失去作為模板的能力。（突變的新生DNA鏈與模板鏈分開）30第四節(jié)

18、 實(shí)例3:基因編碼序列的丙氨酸掃描誘變一、研究目的 對(duì)Foy蛋白60個(gè)氨基酸的小區(qū)域進(jìn)行突變，獲得功能信息 對(duì)基因中10個(gè)帶點(diǎn)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變二、可供利用的資源（略）3132Pvu IPX 和AS1引物Pvu IXma IIIAS1Xma IIIXma IIIAS1體外合成Pvu IPvu IAS1+Pvu I處理AS1Xma IIIXma IIIAS1圖解說明詳見書P6433Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+

19、Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHO

20、HOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA concatemers+Packaging in vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用載體EMBL3A構(gòu)建基因組文庫34Eco R1Sal 1Eco

21、 R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not

22、 precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHOHOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA concatemers+Packaging i

23、n vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用載體EMBL3A構(gòu)建基因組文庫35Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular wei