基因工程的原理和技術(shù)正式

1、第二節(jié) 基因工程的原理和技術(shù)要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連，要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶？需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶？思考題：思考題：重組質(zhì)粒或重組DNA傳統(tǒng)的生產(chǎn)胰島素的方法只能從豬和羊的胰腺中提取,獲得1g胰島素大約需要100Kg的豬胰臟糖尿病治療1978年,科學(xué)家在大腸桿菌中成功表達了人胰島素,并于1982年被美國批準上市基因工程的基本原理基因工程的基本原理 讓人們讓人們感興趣的基因感興趣的基因（目的基因）在（目的基因）在宿主細胞中宿主細胞中穩(wěn)定穩(wěn)定和和高效高效表達。表達?；蚬こ痰幕静僮鞒绦? 1、獲得目的基因、獲得目的基因2 2、形成重組、形成重組DNAD

2、NA分子分子3 3、將重組、將重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細胞分子導(dǎo)入受體細胞4 4、篩選含有目的基因的受體細胞、篩選含有目的基因的受體細胞5 5、目的基因的表達、目的基因的表達剪切剪切拼接拼接導(dǎo)入導(dǎo)入篩選篩選表達表達目前被較廣泛提取目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等?；虿僮鞯幕静襟E基因操作的基本步驟一、提取目的基因一、提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物將需要的基因從供體生物的細胞內(nèi)提取出來。的細胞內(nèi)提取出來。供

3、體生物細胞供體生物細胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶目的基因的序列未知1、從基因文庫中獲取目的基因的序列已知2、利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增3、人工合成獲取目的基因的常用方法： 1、基因文庫的構(gòu)建直接分離法（或鳥槍法）2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因 聚合酶鏈式反應(yīng)，在生物體外復(fù)制特定聚合酶鏈式反應(yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNADNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。因。PCR擴增儀氫鍵斷裂，形成單鏈氫鍵斷裂，形成單鏈DNADNA。引物與引物與DNADNA模板結(jié)合，模板結(jié)合，形成局部雙

4、鏈。形成局部雙鏈。 在酶的作用下，不斷延在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈伸，合成雙鏈DNADNA。多次循環(huán)，獲得大量多次循環(huán)，獲得大量雙鏈雙鏈DNADNA分子。分子。uPCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增目的基目的基因的因的mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄單鏈單鏈DNADNA合成合成雙鏈雙鏈DNADNA（目的基因）（目的基因）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)氨基酸氨基酸序列序列推測推測mRNAmRNA的的核苷酸核苷酸序列序列推推測測結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因的核苷酸的核苷酸序列序列化學(xué)化學(xué)合成合成目目的的基基因因逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸序列直接合成根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA二、二、形成重組DNA分子 核心核心質(zhì)粒質(zhì)粒DNA

5、DNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端目的基因與質(zhì)粒的連接三、將重組三、將重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細胞分子導(dǎo)入受體細胞（1 1）常用的受體細胞：）常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。探究：轉(zhuǎn)基因過程中，怎樣選擇受體細胞？探究：轉(zhuǎn)基因過程中，怎樣選擇受體細胞？ 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因微生物轉(zhuǎn)基因微生物植物體細胞或

6、受精卵植物體細胞或受精卵受精卵受精卵大腸桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌等酵母菌等探究：為什么常用微生物作為受體細胞？探究：為什么常用微生物作為受體細胞？ 目的基因?qū)胧荏w細胞后，就可以隨目的基因?qū)胧荏w細胞后，就可以隨著受體細胞的繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖著受體細胞的繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能夠獲的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。得大量的目的基因。 微生物可通過微生物可通過發(fā)酵發(fā)酵大量繁殖。大量繁殖。（2 2）將目的基因?qū)胛⑸锛毎⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎荏w細胞： 細菌氯化鈣 細胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進入受體細胞目的基因隨受體

7、細胞的繁殖而復(fù)制將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)提純基因表達載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植1.1.將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法2.2.將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎@微注射技術(shù)（最多、最有效）3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎鸆a2+處理，以增加細菌細胞壁的通透性。探究：如何把導(dǎo)入了目的

8、基因的受體細胞探究：如何把導(dǎo)入了目的基因的受體細胞篩選出來？篩選出來？1）原理：2）方法：3）舉例所有受所有受體細胞體細胞接種接種含有四環(huán)素含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基篩選篩選生活的受生活的受體細胞體細胞導(dǎo)入導(dǎo)入重組重組DNADNA分子分子（抗四環(huán)素基因）（抗四環(huán)素基因）培養(yǎng)培養(yǎng)含重組含重組DNADNA分子分子的受體細胞的受體細胞四、篩選有目的基因的受體細胞四、篩選有目的基因的受體細胞質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因利用選擇培養(yǎng)基篩選利用選擇培養(yǎng)基篩選篩選含有目的基因的受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因

9、得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的因。這樣，處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。很少，必須將它從中檢測出來。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。多

10、細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進一步培養(yǎng)、研無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進一步培養(yǎng)、研究。究。例：用棉鈴飼喂棉鈴例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說如蟲吃后中毒死亡，則說明

11、攝入了抗蟲基因并得到明攝入了抗蟲基因并得到表達。表達。 外源基因在受體細胞內(nèi)表達的理論基礎(chǔ)基因是控制生物性狀的基本單位生物界共用一套遺傳密碼遺傳信息的傳遞都遵循中心法則的信息流動方向人胰島素原基因在大腸桿菌中只能表達和人胰島素原，要經(jīng)進一步的加工后才能獲得具生物活性的胰島素。甲生物甲生物乙生物乙生物取出優(yōu)取出優(yōu)秀基因秀基因“剪切剪切”“拼接拼接”新類型新類型表達表達新的生物產(chǎn)品新的生物產(chǎn)品基基因因敲敲除除技技術(shù)術(shù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因技技術(shù)術(shù)生物生物新類型新類型敲敲除除不不利利基基因因新的生物產(chǎn)品新的生物產(chǎn)品能力提升：能力提升：人的糖蛋白必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)人的糖蛋白必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進一步加工合成，通過

12、網(wǎng)和高爾基體進一步加工合成，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以使人的糖蛋白基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以使人的糖蛋白基因得以表達的受體細胞是（得以表達的受體細胞是（ ）A A 大腸桿菌大腸桿菌 B B 酵母菌酵母菌 C T4C T4噬菌體噬菌體 D D 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNAB B知識延伸知識延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的化學(xué)發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的中的同源互補序列雜交，從

13、而檢出所要查明的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因?；蚧颉；蛱结槪―NA探針）與目的基因雜交，有無雜交帶基因工程的基本操作程序目的基因的獲取目的基因的獲取形成重組DNA分子；將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因表達1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、化學(xué)方法人工合成農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法DNADNA分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù)分子檢測外的個體水平鑒定四、本節(jié)小結(jié)：例如：將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)

14、物的進一步培養(yǎng)、研究。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物1 1、用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是 A A常用相同的限制性內(nèi)切酶處理的基因和質(zhì)粒 B BDNADNA連接酶和RNARNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶 C C可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒 D D導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達 B鞏固練習(xí)2下列屬于獲取目的基因的方法的是( )利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從受體細胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A B CDD3基因工程又叫基因拼接技術(shù)。 (1)在該技

15、術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的 為模板， 成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成 。 (2)基因工程中常用的受體細胞有細菌、真菌、 。 (3)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運載體與目的基因，將切割后的運載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有 種環(huán)狀DNA分子，它們分別 是 。信使RNA 逆轉(zhuǎn)錄 雙鏈DNA(目的基因)動植物細胞 3 運載體自連的、目的基因片段自連的、運載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子 4如何利用目的基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗寒能力提高的香蕉植株？在運用轉(zhuǎn)基因香蕉的過程中，在生態(tài)安全方面可能會出

16、現(xiàn)什么問題？（列舉兩點）將目的基因插人土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，構(gòu)建表達載體，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化導(dǎo)人香蕉受體細胞，成功轉(zhuǎn)化的香蕉細胞通過組織培養(yǎng)形成植株。生態(tài)安全問題包括： 外源基因擴散到其他物種（外源基因漂移）；轉(zhuǎn)基因植株擴散影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能；轉(zhuǎn)基因植株擴散對生物多樣性的影響；轉(zhuǎn)基因植物殘體或分泌物對環(huán)境的影響。剪切剪切拼接拼接導(dǎo)入導(dǎo)入表達表達( (四四) )篩選含有目的基因的受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞( (五五) )目的基因的表達目的基因的表達 四、基因工程的基本操作步驟四、基因工程的基本操作步驟人工合成人工合成u利用利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增已知序列：已知序列：從基因文庫獲得

17、從基因文庫獲得未知序列：未知序列：( DNA library )( DNA library )聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)(Polymerase Chain Reaction)化學(xué)合成鳥槍法鳥槍法供體供體細胞細胞DNADNA限限制制酶酶許多許多DNADNA片段片段載入載入運運載載體體導(dǎo)入導(dǎo)入受體受體細胞細胞擴增擴增產(chǎn)生產(chǎn)生特定特定性狀性狀分分離離目目的的基基因因從基因文庫獲得從基因文庫獲得PCR技術(shù) 原理： 前提： 條件 方式DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式擴增，方式擴增， 即即_（n n為擴增循環(huán)的次數(shù)）為擴增循環(huán)的次

18、數(shù)）指數(shù)指數(shù)2 2n n模板DNA、兩個DNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）n 過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸目的基因的檢測與表達目的基因的檢測與表達檢測檢測導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法方法 DNADNA分子雜交分子雜交表達檢測表達檢測轉(zhuǎn)錄檢測轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交分子雜交翻譯檢測翻譯檢測抗原抗體雜交雜交分分子子檢檢測測法法鑒定鑒定抗蟲鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定抗病鑒定活性鑒定等活性鑒定等個體水平的鑒定氫鍵斷裂，形成單鏈氫鍵斷裂，形成單鏈DNADNA。引物與引物與DNADNA模板結(jié)合，模板結(jié)合，形成局部雙鏈。形成局部雙鏈。 在酶的作用下，不斷延在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈伸，合成雙鏈DNADNA。多次循環(huán)，獲得大量多次循環(huán)，獲得大量雙鏈雙鏈DNADNA分子。分子。uPCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。知識延伸知識延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補