(完整版)纖維素酶活力的測(cè)定

1、纖維素酶活力的測(cè)定1. 纖維素酶活力單位定義在 37 ,pH 值為 5.5 的條件下 , 每分鐘從濃度為 4mg/ml 的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1umol 還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位u.2. 測(cè)定原理纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖. 具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS 式劑發(fā)生顯色反應(yīng).反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比 , 而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中纖維素酶的活力成正比 . 因此 , 通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度, 可以計(jì)算反應(yīng)液中纖維素酶的活力 .3. 試劑與溶液除特殊說(shuō)明外, 所用的試劑均為分析純, 水均為符合 GB/T

2、6682 中規(guī)定的三級(jí)水.3.1 葡糖糖溶液,c(C6H12O6) 為 10.0mg/ml:稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖1.000g, 加水溶解 , 定容至 100ml.3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH歷 0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.3 乙酸鈉溶液，c(CH3COONa訥 0.1mol/L:稱(chēng)取三水乙酸鈉 1.36g. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.4 氫氧化鈉溶液，c(NaOH)為200g/L:稱(chēng)取氫氧化鈉 20.0g. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.5 乙酸一一乙酸鈉緩沖溶液，c(CH3COO+ CH3COONa) 0.1mol/

3、L,pH 值為 5.5: 稱(chēng)取三水乙酸鈉 23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解，定容至2000mL測(cè)定溶液的pH值. 如果pH值偏離5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸鈉溶液(3.3)調(diào)節(jié)至5.5.3.6 羧甲基纖維素鈉溶液:0.8%(w/v)稱(chēng)取羧甲基纖維素鈉 (Sigma C5678)0.80g, 加入 80ml 乙酸乙乙酸鈉緩沖溶液(3.5). 磁力攪拌 ,同時(shí)緩慢加熱, 直至羧甲基纖維素鈉完全溶解( 注 : 在攪拌加熱的過(guò)程中可以補(bǔ)加適量的緩沖液, 但是溶液的總體積不能超過(guò)100ml.). 然后停止加熱, 繼續(xù)攪拌 30min, 用乙酸乙乙酸鈉緩沖溶液 (3.5) 定容至

4、100ml. 羧甲基纖維素鈉溶液能立即使用 , 使用前適當(dāng)搖勻 .4 避光保存,有效期為 3 天 .3.7 DNS試劑稱(chēng)取 3,5- 二硝基水楊酸3.15g( 化學(xué)純 ), 加水 500ml, 攪拌 5s, 水浴至45 . 然后逐步加入100ml 氫氧化鈉溶液(3.4), 同時(shí)不斷攪拌, 直到溶液清澈透明 (注意 : 在加入氫氧化鈉過(guò)程中 ,溶液溫度不要超過(guò)48 .). 再逐步加入四水酒石酸鉀鈉 91.0g, 苯酚 2.50g 和無(wú)水亞硫酸鈉1.50 g. 繼續(xù)45水浴加熱, 同時(shí)補(bǔ)加水300ml, 不斷攪拌 , 直到加入的物質(zhì)完全溶解 . 停止加熱, 冷卻至室溫后, 用水定容至1000ml.

5、 用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾 . 取濾液 , 儲(chǔ)存在棕色瓶中 , 避光保存 . 室溫下存放 7 天后可以使用 , 有效期為 6 個(gè)月 . 4 儀器與設(shè)備 4.1 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或碾缽 . 4.2 分樣篩 : 孔徑為 0.25mm(60 目 ).1.51 分析天平 : 感量 0.001g.1.52 pH 計(jì):精確至 0.01.1.53 磁力攪拌器: 附加熱功能.1.54 電磁振蕩器.1.55 燒結(jié)玻璃過(guò)濾器 : 孔徑為 0.45m.1.56 離心機(jī) :2000g 以上 .1.57 恒溫水浴鍋: 溫度控制范圍在30 60 之間, 精度為 0.1 .1.58 秒表 : 每小時(shí)誤差不超過(guò)5s.1.59

6、分光光度計(jì)：能檢測(cè)350800nm的吸光度范圍.1.60 移掖器 ; 精度為 1l.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取緩沖液(3.5)4.0ml,加入DNS試劑(3.7)5.0ml,沸水浴加熱5min.用自來(lái)水冷卻至室溫, 用水定容至25.0ml, 制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣.分別吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和 7.00ml, 分別用緩沖液(3.5)定容至 100ml, 配制成濃度為 0.10 0.70mg/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00ml( 做二個(gè)平行), 分別加入到刻度試管中 ,再分別加入2ml水和5mlDNS式劑(3.

7、7).電磁振蕩3s,沸水浴加熱5min.然后用自來(lái)水冷卻到 室溫，再用水定容至25mL以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對(duì)照調(diào)零，在540nm處測(cè)定吸光度 OD值.以葡萄糖濃度為 丫軸，吸光度OD直為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.每次新配制DNS式劑均需要重新繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線.6 試樣溶液的制備固體試樣應(yīng)粉碎或充分碾碎, 然后過(guò) 60 目篩 ( 孔徑為 0.25mm).稱(chēng)取試樣兩份, 精確至 0.001g. 加入 50ml 乙酸乙酸鈉緩沖溶液(3.5). 磁力攪拌 30min, 再用緩沖溶液 (3.5) 定容至 100ml, 在4條件下避光保存24h. 搖勻 , 取出 30-50ml,2000g 離心3min. 吸取 5.0

8、0ml 上清液 , 再用緩沖溶液(3.5) 做二次稀釋(稀釋后的待測(cè)酶液中纖維素酶活力最好能控制在0.04 0.08 u/ml 之間 ).液體試樣可以直接用乙酸乙酸鈉緩沖溶液(3.5) 進(jìn)行稀釋 , 定容(稀釋后的酶液中纖維素酶活力最好能控制在 0.04 0.08 u/ml之間).如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5,需要用乙酸溶 液(3.2) 或乙酸鈉溶液(3.3) 調(diào)節(jié) , 校正至 5.5, 然后再用緩沖溶液(3.5) 做適當(dāng)定容.7 測(cè)定步驟吸取 10.0ml 羧甲基纖維素鈉溶液(3.6),37 平衡 10min.吸取 10.0ml 經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液,37 平衡 10min.吸取2.00m

9、l經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液(已經(jīng)過(guò)37 c平衡)，加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試 劑(3.7), 電磁振蕩 3s. 然后加入 2.0ml 羧甲基纖維素鈉溶液(3.6),37 保溫 30min, 沸水浴加熱 5min. 用自來(lái)水冷卻至室溫, 加水定容至25ml, 電磁振蕩 3s. 以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照 , 在540nm處測(cè)定吸光度 AB.吸取 2.0ml 經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液( 已經(jīng)過(guò) 37平衡 ), 加入到刻度試管中 , 再加入 2.0ml 羧甲基纖維素鈉(3.6)(已經(jīng)過(guò)37c平衡)，電磁振蕩3s,37 C精確保溫30min.加入5.0mlDNS試劑 (3.7), 電磁振蕩 3s, 酶解反

10、應(yīng) . 沸水浴加熱5min, 用自來(lái)水冷卻至室溫, 加水定容至25ml, 電磁振蕩3s.以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度 AE.8 . 試樣酶活力的計(jì)算(AE - AB)XK + COXD = X 1000 (1) MK t式(1) 中:XD 試樣稀釋液中的纖維素酶活力 ,u/ml;AE 酶反應(yīng)液的吸光度;AB 酶空白樣的吸光度;K 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;CO 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距M 葡萄糖的分子量(180.2);t 酶解反應(yīng)時(shí)間 ,min;1000 轉(zhuǎn)化因子 ,1mmol = 1000 umol.XD值應(yīng)在0.04 0.08 u/ml之間.如果不在這個(gè)范圍內(nèi),應(yīng)重新選擇酶液的稀釋度,再進(jìn)

11、行分 析測(cè)定 .X = XD?Df (2)式(2) 中:X 試樣纖維素酶的活力 ,u/g;Df 試樣的總稀釋倍數(shù).酶活力的計(jì)算值保留三位有效數(shù)字.9 重復(fù)性同一樣品兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)誤差不超過(guò)8.0%, 二者的平均值為最終的酶活力測(cè)定值( 保留三位有效數(shù)字)1.藥品、試劑及儀器脂肪酶（Novezymes 公司），0.0667 mol/L 的 KH2PO4-Na2HPO沖溶液（pH 值為 7.38 ;），月旨肪酸顯色劑（5%醋酸銅溶液，用吡啶調(diào)節(jié)pH=6.2） ，正己烷，油酸，橄欖油，鹽酸，無(wú)水乙醇，分光光度計(jì)， pH 計(jì)，水 / 油浴恒溫磁力攪拌器，離心機(jī)，分析天平等。 2. 脂肪酸吸光度

12、工作曲線的繪制配制一系列不同濃度（1.5 , 2.5 , 3.5 , 4.5 , 5.5 , 6.5 , 7.5 , 10, 12.5 , 15 d mol/mL）的 油酸正己烷溶液，分別取5 mL于10 mL離心管中中，加入1 mL顯色齊山磁力攪拌 3 min ,油酸分子與Cu2+生成綠色的絡(luò)合物，離心后取上層有機(jī)相在714 nm處測(cè)定吸光度。用未加油酸的空白溶液作參比， 以吸光度對(duì)油酸濃度作圖， 得一直線， 即為脂肪酸吸光度工作曲線。 3. 酶液的配置分別稱(chēng)取固定化酶0.1 g 左右溶于2 mL， pH=7.4 ， 0.0667 mol/L 的磷酸緩沖溶液中，振蕩均勻， 40水浴預(yù)熱待用。

13、 4. 酶活測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)組：取3 mL.0.0667 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和 1mL橄欖油，放入超聲儀恒溫50 C超聲10min,加入2 mL（含0.1 g酶制劑）酶溶液（先超聲混勻 10min）,磁力攪拌15min, 立即加入1mL6 mol/L鹽酸溶液和6 mL的95流水乙醇溶液，振蕩2 min ,終止反應(yīng)。分別加 入6 mL正己烷溶液萃取生成的脂肪酸。取上層有機(jī)相5 mL于10 mL離心管中，加入1mL顯色劑，渦旋均勻后，產(chǎn)生的脂肪酸與Cu2+生成綠色絡(luò)合物。靜置離心10 min后，取上層含有脂肪酸銅的正己烷溶液，在 714 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度?？瞻捉M：以相同方法制備不含脂肪酶的空白溶液為參比，