MS培養(yǎng)基及配制注意事項

1、MS培養(yǎng)基母液的配制 母液 成分 規(guī)定量 濃縮 倍數(shù) 稱取量 (mg) 母液 體積 (ml) 配制1升 培養(yǎng)基吸 取量定容 編 號 種 類 1 大 量 元 素 KNO3 1900 10 19000 1000 100 NH4NO3 1650 10 16500 MgSO4- 7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 2 CaCl2 2H2O 440 10 4400 1000 100 3 微 量 元 素 MnSO4- 4H2O 22.3 100 2230 1000 10 ZnSO4- 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83

2、100 83 Na2MoO4 - 7H2O 0.25 100 25 CuSO4.5H2O4 0.025 100 2.5 CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 鐵 鹽 Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 FeSO4.4H2O 27.8 100 2780 5 有 機 物 甘氨酸 2.0 100 100 500 10 鹽酸毗哆醇 0.5 100 25 鹽酸硫鉉素 0.1 100 5 煙酸 0.5 100 25 6 肌酸 100 100 5000 500 10 注意：1 .大量元素按照使用時高 10倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除 CaClCaCl2

3、2H2H2O O單獨配制夕卜，其余化合物混合在 500ml燒杯中加適量蒸儲水溶解，用玻璃棒攪 拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸儲水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標簽注明化合 物名稱(或編號)，濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名， CaCl22H2O配制同上置于另一小口 瓶中。 2.微量元素母液的配制 按要求濃縮 100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽( FeSO4 7H2O和 Na2-EDTA.2H 2O)作為一組單獨配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸儲水溶解后， 定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標簽。 3.鐵鹽配制將 FeSO4 7H2O和Na2-EDTA.

4、2H 2O分別溶于450ml蒸儲水中，加熱，（很重要） 不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào)PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，貼上標簽。 4 .有機物母液配制，按母液要求濃縮 50倍，除蔗糖按3%單獨臨時稱量外，其余分別稱量 后，溶解，定容在 500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標簽。 5. 母液最好在 24C的冰箱中貯存，特別是有機類物質(zhì)，貯存時間不宜過長，無機鹽母液 最好在一個月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。 1. 制備母液和營養(yǎng)培養(yǎng)基時，所用蒸儲水或無離子水必須符合標準要求，化學(xué)藥品必須是 高純度的（分析純）。 2. 稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專

5、用一藥匙。 .生長調(diào)節(jié)劑母液配制： 為了操作方便，節(jié)約時間，生長調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制 培養(yǎng)基時只要稍加計算，按需要量取即可。 不同藥品在配制時若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，荼乙酸（ NAA ），呵噪乙 酸（IAA ），赤霉素（GA3）, 2, 4-D等生長素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然 后加水，如溶解不完全再加熱。激動素（ KT）和6-節(jié)基喋吟（BA）可溶于少量1mol/L的 鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。 稱取50mg生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在 100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生 長調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg,配制后一般要求在低溫（

6、04C）保存，配制培養(yǎng)基時如每升（1000ml） 需添加的生長調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為 0.5mg時，則取1ml母液即可。 二、培養(yǎng)基配制和滅菌 一. 養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序 （一）.母液吸取量的計算 配制培養(yǎng)基的升數(shù) 公式1:母液吸取量=母液體積（CC） X - 母液濃縮倍數(shù) 培養(yǎng)基要求的含量 - （各種生長調(diào)節(jié)劑） 母液每CC的含量 （二）各種母液按順序編號排列 A.大量元素；B.CaCl2.2H2O ； C.微量元素 ；D.鐵鹽； E.有機物； F.生長素荼乙酸（NAA：配制0.5mg/ml的NAA稱取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸儲水定容至 1000ml; G.細胞分裂素、激動素（KT

7、）配制0.5mg/ml的KT 稱50mgKT 用少量1N HCL溶解后，加蒸儲水定容至100ml。 （三）配制培養(yǎng)基（1000ml） 1. 瓊脂：稱取57g瓊脂，加入300ml蒸儲水，加熱溶解直至完全溶解為止 . 2. 蔗糖3%用質(zhì)量較好的白糖代替， 稱取30g白糖，溶于溶有瓊脂的300ml蒸儲水中。 3. 各種母液的吸取（培 養(yǎng)基 1L） 公式2:母液吸取量 （1） 用50ml量筒量取大量元素母液（ A）和CaCl2 2H2。母液（B）各100ml （2） 分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（ C），鐵鹽（D）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有機物（ H） 10ml （4

8、） 移取激素 將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至 80 C左右，用酸度計 或精密PH試紙測定培養(yǎng)基的 PH 一般要求5.86.0，過酸過堿則用 1N NaoH和1N HCL調(diào) 整。 二. 分裝：用一個接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基， 1000ml培養(yǎng)基分裝到25-30個三角瓶 中，每個三角瓶約 30ml左右（一般占試管、三角瓶容量 1/41/3左右）注：培養(yǎng)基勿碰瓶 壁。 三. 包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標明培養(yǎng)基代號即可進行滅菌。 用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水 洗滌干凈，然后按次序放回原處。 三、高壓蒸汽滅菌鍋的使

9、用方法 具體操作步驟： 1. 高壓鍋放水至平把架； 2. 把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋 ； 3. 蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽（注意對角擰緊螺帽）關(guān)上氣閥和安全閥. 4. 然后接通電源. 5. 壓力計升至0.05MPa時，打開放氣閥，排除冷空氣（此步很重要）。 6. 排除冷空氣后，關(guān)閉放氣閥，待壓力升到 0.11MPa位置時，開始計算滅菌時間， 具體方 法：當壓力鍋指針升至 0.12MPa時，關(guān)閉電源，待指針下降至 0.11MPa時接通電源，不斷 重復(fù)此操作過程，維持 20分鐘。 7. 滅菌時間達到20分鐘后，除去電源，打開放氣閥（注意要逐漸放氣）待高壓鍋內(nèi)的空氣完 全排除后，打開熱壓滅菌鍋蓋 （注意

10、對角扭松螺帽）稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。 8. 經(jīng)過滅菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無 微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25 C下保存4 天,如果培養(yǎng)基需要貯存較長時間， 可在4C低 溫下保存。 滅菌高壓鍋有大型臥式、中型立式、小型手提式等多種型號和規(guī)格，無論哪種型號，操 作的步驟都很相近。 進水放進培養(yǎng)基蓋緊鍋蓋 r 關(guān)上放汽閥 r 檢查安全閥 r 接上加熱源 r 待壓力升至 0.05MPa時排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥0.11MPa（121 C）下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力 除熱源逐漸打開放氣閥鍋內(nèi)空氣排除完后開放鍋蓋稍冷后取出培養(yǎng)基。 四、無菌操作技術(shù) （一

11、）植物材料表面消毒劑滅菌 從外界或室內(nèi)選取的植物材料， 都不同程度地帶有各種微生物。 這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基， 便會造成培養(yǎng)基污染。 因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理， 再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到 上，這一過程叫做接種。 1. 接種步驟： 第一步：清理材料 rr 流水沖洗 rr 加入吐溫（或洗衣粉）清洗 rr 自來水沖洗 第二步：對材料的表面浸潤滅菌 ：70%酒精浸10-30秒-無菌水 第三步：滅菌劑處理 r 0.1-1%升汞5-8 min （或其他滅菌劑） 第四步：無菌水進行沖洗 注意事項： 1.1. 滅菌劑一般要臨時配制，現(xiàn)配現(xiàn)用.升汞可以短期儲存. 2 .對去除較容易的滅菌劑滅菌后無菌

12、水沖洗3 -4次，升汞一般5 -8次，每次不少于3 min 3 .滅菌時要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底. 4 .滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。 5 .滅菌液要充分浸沒材料 2.2. 無菌操作可按以下步驟進行： (1) 在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前 3小時打開其內(nèi)紫外線燈進行殺菌； (2) 在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風(fēng)機以及臺上的紫外線燈； (3) 接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等； (4) 上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺面； (5) 先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑲子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)

13、過火尖端 處，對培養(yǎng)皿要過火烤干； (6) 接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等； 材料吸干后，一手拿鑲子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈睢?如葉片切成0.5cm2 的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含 1-2片葉原基)在接種過程中要經(jīng)常 灼燒接種器械，防止交叉污染。 (7) 接種完畢后要清理干凈工作臺， 可用紫外線燈滅菌 30分鐘，若連續(xù)接種，每 5大要大 強度滅菌一次。 常用植物激素 類別 名 稱 縮寫詞 分子量 使用濃度范圍 母液配制 說明 生 2, 4一二氯苯氧乙酸 2, 4- D 221.0 0.001 - 10mg/L 生長素通常 用NaO

14、H溶 IAA易被植物 細胞所氧化。 長 素 a 一蔡乙酸 NAA 186.2 0.001 - 10mg/L 液滴至溶解 成溶液。 能溶于乙醇 故培養(yǎng)基中很 少單獨使用。 呵噪一3一乙酸 IAA 175.2 0.001 - 10mg/L 呵噪一3一丁酸 舊A 203.2 0.001 - 10mg/L 細 6一節(jié)基氨基喋吟 BA 225.2 分裂素通常 能溶于稀 玉米素不耐 熱，不能高壓 胞 分 6-糠基氨基喋吟 KT 215.2 NaOH ,含水 乙醇或稀鹽 滅菌。 裂 N一異戊烯氨基喋吟 (玉米素) ZT 219.2 酸 赤 霉 素 赤霉素 GA3 346.4 能溶于乙醇 不耐熱不能高 壓滅菌

15、在愈傷 組織和懸浮培 養(yǎng)物的啟動和 保持生長時才 需要有時小植 株再生時也需 要 四、常用藥品的配置方法 1.1mol/L HCl1mol/L HCl的配制：根據(jù)鹽酸的密度 37%鹽酸溶液的密度為 1.19克/毫升，假設(shè)要配制 1000ml 1mol/L HCl1mol/L HCl，則需要鹽酸的物質(zhì)的量為 1mol1mol，所以需要量取 37%37%的鹽酸為 1*36.5/37%/11*36.5/37%/1.19=82ml.19=82ml 2.1mol/L1mol/L的NaOHNaOH的配制：稱40gNaOH，然后融于1000ml的蒸儲水中。（定容到100ml） 3.95%95%的酒精配制成 75%75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸儲水即可 得到75%的酒精。 如果用無水酒精配制 75%的酒精，則量取 750ml的無水酒精，再加水 250ml。 4.0.1%0.1%的升汞配制：先稱取1克升汞粉