sds-page凝膠電泳ppt課件

1、SDS-PAGE凝膠電泳 姓名：楊文駿姓名：楊文駿 學(xué)號：學(xué)號：S1309008SDS-PAGE凝膠電泳簡介及應(yīng)用凝膠電泳簡介及應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳的實驗步驟凝膠電泳的實驗步驟本卷須知本卷須知主要內(nèi)容 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速在加速劑和催化劑作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)劑和催化劑作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(PAGE)。聚丙烯酰胺凝

2、膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(PAGE) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。 如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉烷基磺酸鈉(SDS)(SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。 因此可以利用因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。測定蛋白質(zhì)分子量。SDS-P

3、AGESDS-PAGE 凝膠由分離膠和濃縮膠組成：凝膠由分離膠和濃縮膠組成： 上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效應(yīng)，其應(yīng)，其pHpH為為6.86.8，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。大大提高了分辨率。 下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，pHpH為為8.88.8，變性蛋白質(zhì)分子所帶負電荷基本一致，泳，變性蛋白質(zhì)分子所帶負電荷基本一致，泳動速度主要決定于分子量。動

4、速度主要決定于分子量。 1. 安裝制膠模具。安裝制膠模具。 2. 調(diào)制分離膠，立即灌注至模具高度的調(diào)制分離膠，立即灌注至模具高度的70% 。 3. 加一層純水，約加一層純水，約30min后聚合。后聚合。 4. 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。 5.調(diào)制濃縮膠，立即灌注插入梳子。靜置。調(diào)制濃縮膠，立即灌注插入梳子。靜置。實驗步驟 6. 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)品按說明書進行處理，樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)品按說明書進行處理，樣品加入樣品加入ddH2O溶解后，再加入溶解后，再加入SDS上樣緩沖液。上樣緩沖液。 7. 加樣電泳每孔加樣加樣電泳每孔加樣15l）。）。 8.

5、 卸下玻板，剝離凝膠放在器皿內(nèi)，切去一角作為卸下玻板，剝離凝膠放在器皿內(nèi)，切去一角作為方位標(biāo)記。方位標(biāo)記。 9. 染色：用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，于平緩染色：用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，于平緩搖擺平臺上室溫搖擺平臺上室溫1h左右。左右。 10.脫色：用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，至脫色：用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，至蛋白質(zhì)條帶清晰蛋白質(zhì)條帶清晰（1聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套。（2安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，防安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。（3梳子需一次平穩(wěn)插入梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡,梳底需梳底需水平。水平。本卷須知（4微量注射器加樣器上樣時微量注射器加樣器上樣時, 注射器不可過低注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高以防刺破膠體