EGFP_LacZ雙報告基因真核表達載體的構(gòu)建及體外表達

1、2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#研究簡報EGFPIacZ劉莉周政' 采克俊' 張易祥|何湃曹訪'(I湖州師范學院生命料學學院 湖州313000 2蘇州大學生命料學學院 蘇州215006)構(gòu)建C半乳糖昔酶與増強型綠色熒光蛋白(EGFP)雙報告基因的真核表達載體.并在真 核細胞中表達。采用PCR方法從質(zhì)粒pLenti6/V5-GV/LacZ中獲取ScZ全基因.與pEGFP< 1重 組后構(gòu)建真核表達載體PEGFP<1-Lac乙該重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切方法鑒定后在脂質(zhì)體介導(dǎo) 下轉(zhuǎn)染293FT細胞株及鴉胚成纖維細胞

2、.通過熒光觀察和組織化學方法檢測E"p和厶“Z基因的 表達。結(jié)果表明丄次Z基因被克隆到pEGFPCl,成功構(gòu)建了雙報告基因真核表達載體。該重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞呈現(xiàn)綠色熒光組織化學方法檢測到呈藍色的細胞表明兩個報告基因均能在 細胞內(nèi)正確表達。0半乳糖昔酶綠熒光蛋白雙報告基因真核表達Q786© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#© 1994-2010

3、China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#P半乳糖昔酶(“迄)基因和綠色熒光蛋白(green tluo re scent p lutein. GFP)基因是分子生物學及基因工程 中廣泛應(yīng)用的兩個報告基因。厶“Z基因是來自大腸桿 菌乳糖操縱于中的一個基因其最大優(yōu)勢是易于用組 織化學法檢測其原位表達而且其表達產(chǎn)物對細胞的 存活和生長基本無毒性作用"7 是最常用的報告基因 之一。但其不足之處在于.檢測后

4、的細胞不適宜繼續(xù) 培養(yǎng)或是進行其他方法的檢測。GFP來源于海洋生物 水母"7 通過自催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生熒光團即由Ser TynGly形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu).在長波紫外或藍光波長照射 下發(fā)出綠色熒光。由于其基因可以在異源組織中表達 并產(chǎn)生熒光檢測時不需抗體、輔因于、酶底物等其它 成分不影響宿主細胞因而可以鑒定、跟蹤、分選表達 GFP的活細胞，GFP近年來成為細胞生物學和分子生 物學中廣泛應(yīng)用的報告蛋白。綠色熒光蛋白報告基因 同樣也存在不足之處如在生物體內(nèi)易受諸多因素的 影響熒光觀寮受到干擾，影響結(jié)果判斷。Timmons 等用ScZ和奶作為報告研究果蠅基因表達時，發(fā) 現(xiàn)兩個報吿基因在果規(guī)不同組織的

5、表達不同.同時指 出可視化的GFP熒光有利于識別活細胞中的蛋白表 達而LacZ組織化學染色對于監(jiān)測蛋白的原位表達更 靈敏c為避免單一報吿基因給實驗結(jié)果分析帶來誤 差利用 奶作為報吿基因常需要做GFP或目的基因的 免疫組織化學進一步鑒定.或分別用厶"Z報吿基因和 奶報告基因的進行研究以達到相互驗證的 目的鑒于單一報告基因應(yīng)用的局限性和不足.構(gòu)建同 時含有"cZ和 奶兩個報告基因的真孩栽體.對于準 確監(jiān)測體內(nèi)外細胞轉(zhuǎn)染效果具有重要的意義。© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. Al

6、l rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達69收稿日期：2008-06-26 修回日期：2008-09-16國家自然料學基金(30500270)、浙江省科技計劃重點項目 (2005C22052)資助項目電亍信箱：liulihute zj cn1. I.

7、1 質(zhì)粒與菌株 質(zhì)粒PLenti6/V5-LacZ購自 Invitnjgen B io technofogy 公司.質(zhì)粒 pEGFPVl、大腸桿菌DHIOB、293FT細胞均由湖州師范學院細胞研究所實驗 室提供。1. I. 2試劑限制性內(nèi)切酶EcoR I、處”H I、DNA marker、T4 DNA Ligase、Taq酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、 膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品.X-GAL試劑盒為 杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 L ipofectin 購自 Iiivitiogen B io techno logy 公司。1. I- 3引物設(shè)計與臺成 根據(jù)"cZ開

8、放閱讀序列和 PEGFPO載體多克隆酶切位點設(shè)計引物用于擴増 皿迄全基因并連接至載體。上下游引物分別添加 EcoR I和BmH I限制性內(nèi)切酶識別序列及保護性堿 基.其上游引物為：5 f-CCGGATTCCGGCCCCTIVACCA TGX7AGAT-3 '.下游引物為：5 GGGATCKjCGAACCGC GGGCCC7C1AGCT3'。引物由 Invitiogen Bbtechnobgy 公司合成。L 21. 2 1感受態(tài)細胞的制備 挑取大腸桿菌DH10B單 菌落接種于5 ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 過夜再取1 ml培養(yǎng)液接種干100 ml的LB液體

9、培養(yǎng) 基中，37 °咪蕩培養(yǎng)2 5 h左右使ODq值達Q 4左 右採用CaCk法制備感受態(tài)細胞.分裝.并于80°C保 存?zhèn)溆谩?.2 2質(zhì)粒的提取 將含有目的基因PLcnti6/V5- LacZ質(zhì)粒的DHI0B®種接種在含氨節(jié)青毒素的LB平 板上.于37£培養(yǎng)擴增后.提取質(zhì)粒.方法參照質(zhì)粒小 量提取試劑盒說明書進行。同時將含有表達栽體 pEGFPVl質(zhì)粒的DH10B菌種接種在含卡那霉素的LB 平板上371培養(yǎng)擴增提取質(zhì)粒方法同上。1.2 3 LacZQ的基因的PCR擴增、純化、酶切及回收 以PLenti6/V5-LacZ質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)體系按常 規(guī)

10、進行，反應(yīng)條件為94頃變性5 min后，進入30個循 環(huán)：949變性30乂6412退火30s,72°C延伸180s:最后 72 °C延伸20m in。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和BamH I 雙酶切后割膠回收LacZ目的基因片段。1. 2 4車組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定 采用EcoR I和I雙酶切質(zhì)粒pEGFPO.并用膠回收試劑盒回 收pEGFPO載體片段然后利用T4 DNA Ligase與上 述回收的L"Z目的基因片段連接.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DHI0B感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR篩選后提取質(zhì) 粒酶切鑒定車組質(zhì)粒。1.2 5轉(zhuǎn)染細胞的制備 鳩胚成纖維細胞(chicke

11、n anbryo fibrobhst. CEF)取自910日齡的雞胚。將其 除去頭部、翅膀及內(nèi)臟：用ED1A«酶消化后細胞懸 液經(jīng)300目網(wǎng)篩過濾.離心去上清重懸細胞沉淀并計 數(shù)。以5 XI0$個/ml的密度接種到培養(yǎng)瓶中.于 3& 5f、5%CO,、飽和濕度條件下培養(yǎng).待細胞鋪滿培 養(yǎng)瓶底部時.進行常規(guī)消化傳代以5 XI05個/ml的密 度接種于24孔培養(yǎng)板中，于3& 5°C、5%CO2濃度、飽 和濕度條件下培養(yǎng)。待匯片至80%時用于細胞轉(zhuǎn)染。293FT細胞從液氮中取出復(fù)蘇后.傳代。轉(zhuǎn)染前一 天朕酶消化細胞并計數(shù)將細胞鋪到24孔板.使其匯 片至80 %時用

12、干細胞轉(zhuǎn)染。1.2 6車組質(zhì)粒的制備及體外轉(zhuǎn)染真核細胞 將小 量提取并純化的車組質(zhì)粒pEGFP-CI-LacZ和對照質(zhì)粒 pEGFP-CI的DNA調(diào)整濃度為IM g|i 1備用。采用脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin進行轉(zhuǎn)染.方法參照說明書 進行，1. 2 7熒光顯微鏡觀察EGFP在細胞內(nèi)的表達和分布 將上述雞胚成纖維細胞和雞睪丸組織細胞轉(zhuǎn)染48h 后在熒光倒宣顯徹鏡下觀察自發(fā)綠色熒光的被轉(zhuǎn)染 細胞照相記錄。1.2 8 B半乳糖昔酶組織化學染色 將上述熒光觀 察后的細胞進行P半乳糖昔酶組織化學染色鑒定，具 體方法參照說明書進行。染色后在光學顯微鏡下觀 寮并照相記錄。22 1 pEGFP-CI

13、LacZpEGFP-CI質(zhì)粒經(jīng)過EcoR I單酶切x B cun H I單酶 切后電泳顯示有一條單一的4. 7kb的條帶.說明EcoR I和BconH I這兩個酶均為pEGFPVl質(zhì)粒的單酶切位 點。以PLenli6/V5-LacZ為模板對目的基因ScZ的 PCR鑒定電泳顯示有3. Ikb的條帶.符合ScZ全基 因片段的長度(圖1)。上述結(jié)果表明EmR I和 BghH這兩個酶均為pEGFP-CI質(zhì)粒的單酶切位點： 以H.enti6/V5-LacZ為模板經(jīng)過PCR后可以得到3. Ikb 的目的基因片段。2 2 PCRLacZ目的基因與栽體片段體外連接轉(zhuǎn)化后取卡 那每素抗性菌落作為模板進行PCR.

14、篩選重組轉(zhuǎn)化菌 的陽性克隆。得到的陽性克隆經(jīng)擴増后提取質(zhì)粒。該 重組質(zhì)粒命名為pEGFP-CI-LacZ.同時進行酶切鑒定。 結(jié)果表明瑩組質(zhì)粒經(jīng)過EcoR I單酶切獲得7. 8kb的M I 231 pEGFP-ClLacZF|j 1Kent frat ion of pEGFP-Cl by restrictionanahsis and ainplffrathn of LacZ gene by PCRMA *7/勿dill dipest DNA marker 1: pEGFPCl digested by2: pEGFP<l digested by Hcan H I 3: LacZ gene

15、anp lified byPCR with pLenti6/V5-LacZ phsiiid as temp late單一條帶質(zhì)粒大小與預(yù)期相符;經(jīng)EcoR I和3創(chuàng)H I 雙酶切后顯示有兩條分別為4. 7 kb和3. 1 kb的條帶 (圖2).符合pEGFP-CI栽體和ScZ全基因的長度.進 一步驗證了重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-LacZ已構(gòu)建成功。M 123F© 2 klentffirathn of recmibhant phsn idpEGFP-CH.acZ by restrrtbn anatysisMA A/indlll digest DNA maiken 1: pEGFPCl

16、digested by £涼I:2 pEGmiLacZ digested by Ec(jR 1: 3: pEGFP-Cl-LacZdigested by £<oR I andI2 3CEF. 293FT圖3 EGFP-I41CZ雙報告基因在(EF 細胞中的表達(200 x)Fig.3 Pho expression of E(IFP-l.acZ double reporter in Chicken Embryo Fibroblast(a) : Cn-cti fluorixn'iicr of CEF Inumfected l>> |»ECFP

17、-C1 ( b)： Gren fluorescence of CEE transfected In pECEP-Cl - LacZ ( c)： HitcM'lwMnistn for l>etM-g8la<kl<»M<lasc activity of (：l卜 traMfediHl l>v pECF P-f-l (I) : llil<ich<#miMr foru<iivilvof (2EEb pE(iFP-CI -licZ l>ar 20|im圖4 EGFP-LacZ雙報告基因在293IT 細胞中的表達(2«0x)

18、Hg. 4 The expression of E(JKP-LacZ double reporter in 293FT cell line(a) ：(>n*en fluorescence of 293 KT transfcx*lr<l by pEdFP-t A ；( l>): (；n*rn fliM»n*M rnrr nf 293KI transfert<iI by |>|-(JKP-f J -Lu Z ( <): lliKl<M*lirmiKln f<H Im*I.i gdlarhi>iil.iM' .irlnih of

19、 29Ml Irnnsfrrh'd by pEGFIMJl (<1) IliM'licnnMry Gm iM'ki-gulm hi<l«iM* :M livih of 293Fl* translectrd by pE(；FP(：l 1創(chuàng) / Lar = 20pjn用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將車組質(zhì)粒pEGFP-CI-LacZ導(dǎo)入 CEF.293FT細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后.用熒光倒直顯微鏡 觀察轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pEGFPO和重組質(zhì)粒pEGFP-CI- LacZ的細胞均很容易觀察到綠色熒光：對轉(zhuǎn)染細胞進 行P半乳糖昔誨組織化學染色其中pEGFPOlacZ 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

20、的細胞呈藍色.而對照質(zhì)粒pEGFP-CI轉(zhuǎn) 染的細胞呈陰性（圖3.圖4）。結(jié)果表明pEGFP-Cl- LacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后中既能表達EGFP.又能表達 L“Z.進一步證實ScZ基因巳經(jīng)插入pEGFPCl載體. 并且能正確表達。3GFP是從一種能自體發(fā)光的水母Aequoira victoria 中分離出來的蛋白質(zhì)它能夠在紫外線的激發(fā)下發(fā)出 明亮的綠色熒光。EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP.其 所產(chǎn)生的熒光要比野生型GFP強35倍.大大増強了該 報告分子的靈敎度。而與其它常用的報告基因相 比.GFP具有性質(zhì)徳定、無細胞毒性、靈敏性、檢測便捷 等優(yōu)點在熒光顯微鏡下可直接觀寮到活細胞中的 GFP綠色

21、熒光.因此可作為研究與之融臺的其他蛋白 表達的報吿基因。近年來基因作為一種報吿基因 越來越受到人們的關(guān)注，目前也存在著許多問題。如 熒光強度的非線性性質(zhì)使其定量非常困難：紫外激發(fā) 對某些GFP有光漂白和破壞作用.導(dǎo)致熒光快速消失 （對組織或細胞進行綠色熒光蛋白觀察時.在紫外光下 長時間照射會導(dǎo)致細胞的綠色熒光減弱現(xiàn)象）；多數(shù)生 物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象并有類似的激發(fā)和發(fā)射 波長影響了某些GFP的檢測叩。筆者在實驗過程中. 將 曲基因?qū)腚u體內(nèi)表達檢測時發(fā)現(xiàn)除了因egfp 基因表達呈現(xiàn)的綠色熒光外還有部分細胞出現(xiàn)了黃綠 色熒光現(xiàn)象對于準確判斷曲基因的表達產(chǎn)生了干 擾。為了克服該報吿基因的局限性保

22、證對實驗結(jié)果 的準確判斷我們在昭基因的基礎(chǔ)上再引入卩半乳 糖昔酶報吿基因并構(gòu)建成EGFP-LacZ雙報告基因真核 表達載體。P半乳糖昔酶在分于生物學和基因工程中是一種 理想的組化標記分子.與底物反應(yīng)著色后可以長時 間放置并在普通顯微鏡下觀察克服了 EGFP因其在紫 外光下長時間照射而導(dǎo)致細胞的綠色熒光減弱現(xiàn)象。 它在哺乳動物細胞、酵母、果蠅等細胞中的表達不表現(xiàn) 出對宿主細胞有害性。用于檢測B半乳糖昔酶生色測 定方法非常靈敏，可以產(chǎn)生非擴散的顏色很亮的產(chǎn)物 而且不易受到背景染色的干擾。目前由于卩半乳糖昔 酶基因來源方便、穩(wěn)定、產(chǎn)物易于檢測等優(yōu)點，已被廣 泛用于基因研究的各個方面。本研究構(gòu)建的EG

23、FP- LacZ雙報吿基因為融合基因在真核細胞中都能表達. 更能有效指示外源基因的表達。例如在一般情況下 可利用EGFP方便、直觀地示蹤外源基因的表達.尤其 是活細胞或活體觀察具有很大的優(yōu)勢；但如果觀察 EGFP時有干擾.難以確定時可利用LacZ組織化學法 指示外源基因的表達使結(jié)果更為準確、可靠而且也 較其他方法如表達產(chǎn)物的免疫組織化學法更簡便。McGiwv等在轉(zhuǎn)基因胸技術(shù)的研究中將e奶和 LacZ因構(gòu)建在同一慢病毒栽體上對轉(zhuǎn)基因雞的制 作效率進行研究雙報告基因的作用得到了很好的發(fā) 揮。晨近.Elghazi等'利用厶“Z和 冊雙報告基因的 小鼠模型較好地評估了體內(nèi)絲佛氨酸蛋白激酶Akt

24、 在發(fā)育階段不同組織中的活性也顯示了兩個報告基 因的互補性。本研究將攜帶紹巾基因的質(zhì)粒pEGFP-Cl.pEGFP- Cl-LacZ通過脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染至CEF. 293FT細胞 中.右熒光顯微鏡下對報告基因表達的蛋白進行定位 觀察°從圖3和圖4的（G圖我們發(fā)現(xiàn)單一的皿基 因表達的綠色熒光蛋白分布于整個細胞其中核內(nèi)的 熒光亮度要高于細胞質(zhì)。而在圖3和圖4的（b）圖.我 們發(fā)現(xiàn)無論是在CEF還是293FT細胞中轉(zhuǎn)染EGFP- LacZ雙報告基因后.在其細胞質(zhì)中都呈現(xiàn)顆粒狀綠色 熒光現(xiàn)象而細胞核則并未出現(xiàn)熒光。這一現(xiàn)象與卩 半乳糖昔酶是一種細胞質(zhì)酶有關(guān).而顆粒狀的綠色熒 光則是由于該蛋白

25、是在球形的核糖體上合成所致。 重組栽體中EGFP-LacZ為融合基因表達的產(chǎn)物為融 合蛋白。EGFP本身無特定的胞質(zhì)定位序列，但在核中 的分布略強我們推測與EGFP中含弱化的核定位序列 有關(guān) .但由于卩半乳糖昔酶是一種細胞質(zhì)酶且分 于量較EGFP大.因而EGFP-LacZ融合蛋白就主耍在 胞質(zhì)中分布了 這也賦予了該載體一個新的特征。不 過.P半乳糖甘酶在細胞質(zhì)中定位是相對的在厶“迄基 因3末端接入一個編碼猴病毒40 （SV 40）大T抗原信 號肽的核定位序列后.該基因就可以在細胞核中定位 表達。本研究用構(gòu)建好的車組質(zhì)粒分別對CEF和293FT 細胞轉(zhuǎn)染。但不論從綠色熒光還是組織化學染色結(jié)果 來

26、看.293FT細胞的轉(zhuǎn)染效率要遠髙于CEF細胞.表明 細胞的類型和特性與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)因為實驗所 用兩種細胞的來源和性質(zhì)完全不同.CEF是來自于雞 胚的天然成纖維細胞而293FT則是一種改造過的人 胚腎細胞。雙報告基因在兩種細胞中均能正確表達. 也揭示了該載體具有較為廣泛的適用性。本研究構(gòu)建 的雙報告基因真核表達載體將為分析外源基因在體內(nèi) 外的寢達示蹤提供更為準確的分子工具。1 ： Goring D R Rossant J. Ckipoff S. et al h situ detection of beta*galactosidase in Lenses of transgenic mice

27、 with a ganma cQrsUllin LacZ gene Science. 1987, 235 (4787) : 456 45&2 | Sanes J R. Rubenstein J L Nicolas J E Use of a recvnibinanl rvtmuvinjs t) study posrmplanunion lineage in mouse cmbnos IMBO. 1986. 5(12) : 313331423 ftnsher D C. Eckeniode V L Ward W W. et al Prmaty Structuiv of the A cquot

28、va V k io ria green fluorescent pmlein Gene. 1992. 111 (2) : 2292334 Coniack B P, Valdivia R H Falkw S EACS-oplmized mutants of the green iluoivsccnt piuteiii ( GIT). Gene 1996. 173 (I Spec No) : 33385 ThimonsL Becker J Barthmaier P. et al Green fluorescent p iolein /be ti-galac Idsidase double repo

29、rters for visualizing Divlfhila gene expresspn patterns Dev Genet. 199/. 20(4): 338-3476 Castro PH. Oppemann M, Weiss Y. et al Reporter gene rconibinalDn in juxtagkincmlar granuhr and collecting duct cells by hinian ivnin pimioicrCre reorobinase transgene Physiol Genomics. 2006.25(2): 2772857 Lqx)re

30、 D A. Ihcnias G P Knighl K R et al Sunrival and diflervntiatbn of pituitary cobny-foning cells in vhvi SlcniCells,2007 .25(7): 1730-1736I 8唐孝音-李斌伍小兵等 綠色熒光蛋白及其應(yīng)用的研究 進展 陜西農(nóng)業(yè)科學,2007. 1: 123-125Tang X Q. Li B. Wu X B et al Shaanxi Journal of Agricultural Sciences. 2007. 1: 123125【9 J薩姆布魯克.D W拉塞爾.分于克隆實驗指

31、南.第三版北 京:科學出版社.2002 14131416Simbmok J. Russel D W. Molecuhr Cloning: A Laboratory Manunal 3" ed. Beijing: Science Press. 2(X)2 1413 141610| McGiw M J. She man A. Ella id F M. el al Efficient pmductbn of gem line tninsgenic chickens using lentivinil «ectore BIBO. 2004. 5(7): 728733111 Ehazi

32、 L. Weiss A J Gould A P. et ai Gencratbn of a reporter mouse Ime expressing Akt and EGb Eupon Crc- mediated Tvcmbination Genesis 2008. 46(5): 256264I】2|劉莉釆克俊.張易禪等 抗病毒基因MxA熹核表達載體 的構(gòu)逹及在型細胞中的表達.細胞生物學雜志.2008. 30 (2): 201205Liu L, Cai K J. Zhang Y X. et al Chinese Journal of Cell Bobgy. 2008.30(2): 201 2

33、05© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009,29(1)劉莉等：EGFP-LacZ雙報告基因真核表達栽體的構(gòu)建及體外表達#Construction of tlie Express bn

34、Vector with Double Report Gene ofEGFPiacZ and Its Expression in V itroLLJ Li* ZHOU Zlieng CAI Ke-jun ZHANG Yi-xiang HE Pai' CAO Fang(1 Sclxx) I of Life Sciences. Huzlx)u Teachers Co I kgc. Huzhou 313(XX). China)(2 College of Life Sciences. Suzhou University. Suzhou 215006. China)Abstract The a in of the study was to construct the recombinant veebr with double report gene of EGFP LacZ which was expressed in eukaiyotic cells LacZ gene was amplified by PCR with pLenli6/