單克隆抗體制備試驗過程

1、單克隆抗體制備實驗過程一、 免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫 方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏 B 淋巴細胞。說明：FCA弗氏完全佐劑；FIA,弗氏不完全佐劑； Quickantibody ,北京康碧泉公司研制 的佐劑。上表中第四種免疫方法產(chǎn)生的抗體大部份都為IgM,存在親和力弱等缺點，慎用。PS： 1、一般皮下注射每個注射點注射 30-50ul左右混有佐劑的抗原， 每只小鼠注射6-8個點為宜。2 、腹腔注射時，如果

2、抗原混有弗氏佐劑，建議注射在左側(cè)腹 腔，如果采用右側(cè)腹腔注射，則在免疫過程中，很容易導致小鼠脾臟 與腹膜粘連的情況，造成后期取出脾臟麻煩。3 、沖擊免疫完成后，應在96小時內(nèi)完成細胞融合，否則相應 的B細胞數(shù)量會下降到未沖擊前的水平。二、細胞融合(Cell fusion )【材料和試劑】(1)骨髓瘤細胞懸液 選好骨髓瘤細胞株，取體外培養(yǎng)對數(shù)生 長期細胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細胞，制備細胞懸液。(2)免疫小鼠脾細胞懸液取3天前加強免疫的小鼠，眼眶放血，？分離血清凍存?zhèn)溆?。拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中35min。 無菌操作取出脾臟，置入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中洗滌，剪去 周圍的結(jié)締組

3、織，將脾臟移入另一盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中的 鋼網(wǎng)上，先用剪刀剪成35個小塊，然后用注射器內(nèi)芯研磨。將脾 臟細胞懸液移至50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液 50ml, 1000r/min 離心5min,棄上清，再以同法洗滌離心一次。然后將沉淀細胞重新 懸浮于10ml不完全培養(yǎng)液中，計活細胞數(shù)，一般一只小鼠可得0.5 2X 108個脾細胞。(3)飼養(yǎng)細胞 將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鐐從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射 器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注 射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的

4、培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細胞懸浮，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，補加HAT培養(yǎng)基， 使細胞濃度為2X105/ml,備用。(4)主要試劑的配制細胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium )兩種基礎培養(yǎng)基，配好后過濾除菌 (0.22um),分裝，4c保存。完全RPMI-1640或DMEMg養(yǎng)基:不完全RPMI-1640或DMEMf養(yǎng)基80ml小牛血清15-20mlHT或HA信養(yǎng)基:HI A口 4HAT土口加基完全RPMI-1640或DMEMf養(yǎng)基99ml98m

5、lHT貯存液1ml1mlA貯存液1ml氨基喋吟(A)貯存液(100X , 4X 10-5mol/L)稱取1.76mg氨基喋吟(Aminopterin MW 440.4 ),溶于90ml超純水或四蒸 水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至 100ml。過濾除 菌，分裝小瓶(2ml/瓶)，-20 C保存。次黃喋吟和胸腺喀呢核甘(HT)貯存液(100X, H: 10-2mol/L, T: 1.6 x 10-3mol/L)稱取136.1mg次黃喋吟（Hypoxanthine , MW 136.1）和38.8mg胸腺喀呢核 昔（Thymidine, MW 2422,加超

6、純水或四蒸水至 100ml,置45-50 C水浴中使 完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20 C凍存。用前可置37c加溫助 溶。L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X , 0.2mol/L ）稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine , MW 146.15,用100ml不完全培養(yǎng) 液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20C凍存。青、鏈霉素（雙抗）溶液（100X）取青霉素G （鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超 純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20 C凍存。 7.5% NaHCO§ 液稱取

7、分析純NaHC。.5g ,溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝 小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4 c保存。HEPE豁液（1mol/L）稱取 23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N, -2-ethanesulfonicacid , N-2-羥乙基哌嗪-N, -2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超純水或四蒸 水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4c保存。8-氮鳥喋吟貯存液（100X）稱取 200mg8-氮鳥喋吟（8-azaguanine , MW152.1 ）,力口入 4mol/L NaOHlml, 待其溶解后，加入超純水

8、或四蒸水 99ml,過濾除菌；分裝小瓶，-20 C凍存。使 用時按1麻度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為 20ug/ml）。 50% PEG稱取PEG1000或4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80C水浴融化，0.6ml 分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20 C存放備用。臨用前加 熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許 7.5% NaHCOM PH至8.0 ,或購買Sigma 或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。（5） 24孔及96孔培養(yǎng)板等細胞培養(yǎng)所用材料和試劑?！静僮鞑襟E】（1）將準備好的骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按1: 51: 10比例混合，？加入2050ml RPMI-1640液

9、。（2） 1000r/min X610min離心棄上清，將上清盡量吸凈。（3）用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細胞分散，將離心管 置37c水浴中。（4）吸取1ml 37c預溫的50% PEG諼慢滴入離心管內(nèi)，45秒 左右加完，邊加邊輕輕攪拌，37 c靜置15min。（5）在5min內(nèi)滴加不完全完全培養(yǎng)液（37C預溫）20ml,第一分 鐘內(nèi)滴加1ml,第2分鐘2ml,第3分鐘5ml,第4和第5分鐘各6ml, 同時應邊加邊輕輕地轉(zhuǎn)動離心管，應沿管壁滴加，不應直接滴加在沉淀細胞上，以防將剛?cè)诤系募毎麤_開。然后加1640液至50ml使PEG 作用終止。(6) 800r/minX510min 離心，棄上

10、清。(7) ?將沉淀細胞輕輕懸浮于所需容積的 HAT培養(yǎng)液中，接種 24孔板(每孔1.0-1.5ml)或96孔培養(yǎng)板(每孔0.10-0.15ml)。(8)接種完畢后，將培養(yǎng)板放入 37C 5%CO2溫箱中培養(yǎng)。 PS：1、凍存的骨髓瘤細胞在復蘇后要 2周時間才能處于適合于融合 的狀態(tài)，培養(yǎng)目標是使處于對數(shù)生長的時間盡可能長。2 、飼養(yǎng)層細胞應在使的前一天制備好，這樣才能分泌足夠的細 胞因子。三、選擇性培養(yǎng)原理：在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃喋吟 - 鳥喋吟-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNAB死亡。未融 合的淋巴細胞雖具有次黃喋吟-鳥喋吟-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不 能

11、在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞 獲得了次黃喋吟鳥喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增 殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。(1)接種24孔板或96孔板5天后，用HATW養(yǎng)基換出1/2培 養(yǎng)基。(2) 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；(第14天后可用 普通完全培養(yǎng)基)。PS:1、經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上 時吸出上清供抗體檢測。四、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，選用抗體檢測方法的原 則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節(jié)省人力，通常根據(jù)所研究 的抗原和實驗室的條件而定，一般制備單

12、抗的目的決定了篩選克隆所 用的方法。由于融合后，細胞上清份數(shù)多，但每份體積有限，因此 ELISA是最適合用于初步篩選的方法。經(jīng)過 ELISA篩選出的陽性克 隆即可進行克隆化，因為如果不進行克隆化，當陽性孔有非抗體分泌 型的雜交瘤時，非抗體分泌型的雜交瘤由于生長速度更快，將會占主導生長，最終很難分離出目標雜交瘤以至丟失。另外雜交瘤細胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的 能力。通常在得到針對預定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進行2-3次克隆化，有時還需進行多次。克隆化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂 法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分類儀(FACS

13、)分離法。(1)包被 將抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每塊酶 標板以5-20 ug抗原為宜(如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加 大包被量)。每孔的包被體積為50-100 ulo 37 C包被2 h或4 C包被 過夜。(2)封閉 倒掉抗原，拍干酶標板孔內(nèi)液體，以0.5-1% BSA (用 PBST溶解)或5%脫脂牛奶(PBST溶解)或1%明膠(PBST溶解) 于37 C封閉2 h或4 C封閉過夜，也可以使用10%小牛血清或其它 無關(guān)物種血清封閉。封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于4 C 密封保存以備后面使用。(3) 一抗 封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入待檢測細胞 上

14、清，每孔100 ul為宜。在每塊板子上做好記號。37 C孵育1 ho(4)二抗 孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以 PBST洗 滌3次，每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋好二抗，每孔加入100 ul.37 C 孵育1 ho(5)顯色 孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑。 待顏色最深時用終止液終止反應。 用酶標儀讀出各孔OD值，選擇出 陽性孔。(1)有限稀釋法從有限稀釋的原理以及影響因素可以知道， 其克隆化結(jié)果應該是 一個修正的泊松分布：式中入在有限稀釋里的意義是稀釋時設計的每孔細胞的平均 數(shù),k則代表可能出現(xiàn)的細胞個數(shù)。材料：a、96孔細胞培養(yǎng)板等；b、HT培養(yǎng)基；c、活力強的雜 交瘤

15、細胞；d、小鼠腹腔細胞。方法：a、制備飼養(yǎng)細胞(小鼠腹腔細胞)。b、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞3中不同的稀釋度。c、按每毫升加入5X 104-1 X 105細胞的比例，在上述雜交 瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。d、每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔, 每孔量為0.2ml,每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為 0.5、3和10。e、37C、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的 克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。f、取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。g、本法中

16、（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤 細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含 10個細胞，按每孔接種 0.1ml細胞懸液，即每孔含1個細胞。（2）軟瓊脂法材料：a、HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b、用0.15mol/L NaCl配制的 2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl, 121c高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4c保存。 c、小鼠腹腔細胞。d、滅菌平皿。e、45 c水浴。f、活力很好的雜交 瘤細胞。方法：a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細胞（小鼠腹腔細胞）單層。b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，

17、配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45 c水浴中溫育。c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml,室溫10 分鐘。d、取雜交瘤細胞懸液1ml,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻， 鋪于上層。e、37C、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時，用毛 細吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細胞的 24孔板，擴大培養(yǎng)。f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、 凍存。PS： 1、細胞融合后，一旦鑒定可以產(chǎn)生目標抗體，就應立即進行 克隆化，確保能分離出單個細胞重新形成克隆。2、經(jīng)多次嘗試，確定修正公式中的 a值，為以后的實驗提供 一個比較穩(wěn)定的經(jīng)驗入值。3、應在克隆前1天制備好飼養(yǎng)細胞層。五

18、、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生腹水法和體外培 養(yǎng)法。1 .用20G或22G的注射針，小鼠腹膜內(nèi)注射降植烷，每只鼠0.5 1 ml, 1周后接種細胞。2 .在175 cm2培養(yǎng)瓶中加完全 DMEM-10/HEPES/丙酮酸鈉培養(yǎng) 液，進行雜交瘤細胞的培養(yǎng)，使細胞生長至對數(shù)期。3 .將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 ml錐形離心管中，室溫下500 g離心5 min。4 .細胞重懸于50 ml無菌的PBS或HBSS （不含F(xiàn)BS）中洗滌。 然后室溫下500 g離心5 min,棄上清。重復2次，然后細胞重懸于 5 ml 的 PBS或 HBSS 中。5 .計數(shù)細胞，通過臺盼藍染色法確定細

19、胞活力。6 .用不含F(xiàn)BS的HBSS或PBS調(diào)整細胞濃度至2.5X102細胞 /ml。7 .用一個10 ml的無菌的帶22G針頭的注射器，對裸鼠進行腹 膜內(nèi)注射2 ml細胞，等待腹水形成（12周）。8 .收獲腹水。（1） 一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮膚繃緊。（2）另一只手將一只18G的計頭插入小鼠腹腔12 cm深。（3）進針部位為左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官， 以及腹中線處的主要大血管。（4）令腹水滴入一只無菌的15 ml聚丙烯錐形離心管中。9 .于室溫下，1 500 g離心腹水10 min,收集上清，棄沉淀，將 腹水存放于4C,直到收集腹水的工作完成（在 1周內(nèi)）。10

20、.再次收獲腹水前，讓小鼠再次積累腹水（23天），具體操作 同步驟8,腹水的加工處理操作同步驟 9。重復這個過程直到再沒有 腹水產(chǎn)生可供收集，或者小鼠健康狀況不佳。11 .把在幾天內(nèi)收集到的腹水匯集到一起， 于56c水浴45 min進 行熱處理，如果凝塊形成，可用牙簽挑出除之，然后再離心。12 .采用適當?shù)姆椒z測腹水中的 MAb的效價。13 .按大于1: 10的比例稀釋MAb,并進行濾過除菌，濾膜孔徑 為0.45 m,分裝并凍存于-70C,避免反復凍融，可凍存數(shù)年之久。 PS： 1、腹水含有大量的油脂、巨噬細胞、雜交瘤細胞、腹腔內(nèi)的 上皮細胞、血液中的細胞成份等雜質(zhì)，應先離心除去這些成份。2、

21、油脂的密度比較小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟 掉即可。六、辛酸-硫酸鏤兩步沉淀法純化單抗1、原理在酸性條件下（pH4.5）,非IgG的蛋白成份（包括白蛋白，部分Ig）, 能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要為 IgG,再用硫 酸鏤沉淀上清，即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸鏤法比硫酸鏤法 能夠獲得更高純度的IgG。2、方法（1）將腹水用0.06 M醋酸鈉（pH4.0）按1:3稀釋，用1mol/L NaOH 調(diào)至血清稀釋液為pH4.5。(2)室溫下邊攪拌(磁力攪拌器 或電功攪拌器)，邊緩慢滴加辛酸 (一般按每毫升稀釋前的腹水加入 40 ul正辛酸)，滴加完后繼續(xù)攪拌 30min

22、。(3) 4 C 靜置 2 ho(4) 4 C 10000 g離心20min,可見辛酸因溫度低而從系統(tǒng)中結(jié)晶 析出漂浮在腹水上層，用多層紗布過濾，棄去此結(jié)晶以及底部沉淀， 收集上清夜。(5)向上清中加入1/10體積的10XPBS (0.1M, pH 7.4)。(6) 4 C條件下，向其中加入飽和硫酸鏤溶液，使終濃度為45%飽和度，靜置1h以上。(3) 10000 g離心10-20min;棄上清，將沉淀溶于適量1XPBS中， 再將其裝入透析袋用10mM的tris或PBS透析(透析液應為抗體體 積的100倍以上，最好攪拌)，4 C過夜。(4)收集透析好的抗體，直接現(xiàn)用或加入保護劑和防腐劑長期保存(-20 C保存或凍干保存)。用這種方法純化出來的抗體純度可達80-90%左右，損失較少，對抗體的活性損失也較少，試劑成本低，但是操作比較費時。3、蛋白含量測定紫外分光光度法測樣品在波長260nm, 280nm處的I及收光度(A 260, A 280),蛋白含量按以下公式計算蛋白量(g/L) =(1.4