分子克隆工具酶

1、基因工程基因工程基因工程1 基因工程概論2 天然DNA的制備3 分子克隆工具酶4 分子克隆載體5 表達(dá)載體 6 PCR技術(shù)及其應(yīng)用 7 基因文庫(kù)的構(gòu)建 8 基因克隆的篩選策略 10 細(xì)菌基因工程 11 酵母基因工程 12 植物基因工程 13動(dòng)物基因工程 14 基因工程的安全9 轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)3 分子克隆工具酶3.1 限制性核酸內(nèi)切酶與DNA切割 概念： （restriction endonuclease）一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 生物學(xué)意義：是生物細(xì)胞內(nèi)限制性修飾系統(tǒng)的一部分，可防止

2、外源DNA的入侵（圖）。生物在長(zhǎng)期的演化過程中，含某種限制性核酸內(nèi)切酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列，或者通過甲基化酶把甲基轉(zhuǎn)移到識(shí)別序列的堿基上，保護(hù)相應(yīng)序列不被酶切割。 分布：細(xì)菌、少數(shù)霉菌和藍(lán)藻中也有。 類型：即I、II和III型酶，各具特性(表)。分子生物學(xué)和基因工程操作中用的是II型酶。Phage injects DNA into E. coliRE binds to phage DNAPhage DNA is cleavedRE cannot binds to recognition sequenceRecognition sequence are

3、methylatedE. coli DNAThe restriction and modification system in E. coli 命名：以酶的來源生物的屬名和種名的第1、2個(gè)字母以及菌株（型）的代號(hào)來命名。如果從同一生物中先后提取到多種限制性核酸內(nèi)切酶，則依次用羅馬數(shù)字表示。例如，從 Haemophilus influenzae Rd中提取到的第三種限制性核酸內(nèi)切酶被命名為Hind III。 作用機(jī)制：以環(huán)狀和線形的雙鏈DNA為底物，在合適的反應(yīng)條件下，識(shí)別特定的核苷酸序列，使兩條核糖核苷酸鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3-OH基團(tuán)和5-P基團(tuán)的片段(圖)。黏性 (突出)

4、末端的產(chǎn)生 內(nèi)切酶造成DNA分子的斷裂類型 （i）黏性（突出）末端: 兩鏈的斷裂位置交錯(cuò)、對(duì)稱地繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列所形成的斷裂。 （ii）平末端：兩條鏈上的斷裂位置處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心所形式的斷裂。 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 與I及III型限制酶不同，II型酶只有一種多肽，并常以同源二聚體存在，具三個(gè)基本特性：（i）在DNA雙鏈的特異識(shí)別序列切割DNA，產(chǎn)生斷裂；（ii）通常2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上不直接相對(duì)；（iii）因此，斷裂形成的片段往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。 識(shí)別序列：能識(shí)別的核酸鏈上特殊的核苷酸序列。絕大多數(shù)的II型酶的識(shí)別序列由48個(gè)特定的核苷酸組成，其中以6個(gè)為

5、多。II型酶從識(shí)別序列內(nèi)切割DNA，識(shí)別序列多連續(xù) (如GATC），少間斷（如GANTC），其共同特點(diǎn)是，雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式，即回文結(jié)構(gòu)(圖). 切割位點(diǎn)就旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸而言位于對(duì)稱的位置。產(chǎn)生黏性末端有兩類：3-OH; 5-P。3-OH 5-P DNA的識(shí)別序列數(shù)：在隨機(jī)排列的DNA中，由n個(gè)核苷酸組成的內(nèi)切酶識(shí)別序列出現(xiàn)一次的概率為4n。 有的限制酶識(shí)別序列包含在另一種限制酶識(shí)別之內(nèi)(如Sau3AI ：GATC； BamHI： GGATCC) 。 識(shí)別序列的多樣化：一些限制酶能識(shí)別多種核苷酸序列，如HindII。 同裂酶：識(shí)別序列相同而來源不同的酶(isoschizomer)。 同裂酶的用

6、途：有些同裂酶對(duì)堿基甲基化的敏感性不同，可用來研究DNA甲基化作用。例如， HpaII和MspI的靶子是CCGG。當(dāng)靶序列中有5-甲基胞嘧啶（C *C G G，*：甲基化堿基）時(shí)，HpaII不能切割，而MspI能切割。 同尾酶：來源和識(shí)別序列各不相同，但產(chǎn)生出相同粘性末端的酶（isocaudamer）。如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII，產(chǎn)生粘性末端GATC。 同尾酶用途：同尾酶產(chǎn)生的粘性末端，能夠通過之間的互補(bǔ)作用而彼此連接。 由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，特稱之為“雜種位點(diǎn)”（hybrid site），一般不能再被原來的任何一種酶所識(shí)別，不過亦

7、有例外（表）。U：Pu，嘌呤；Y：Py，嘧啶 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因子 DNA的純度：消化速率取決于DNA的純度。DNA制劑的污染物有蛋白、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、以及鹽離子等，都可能抑制制酶活。 解決途徑 增加酶量，每微克DNA可高達(dá)10單位或以上。 擴(kuò)大反應(yīng)體積，以稀釋抑制因素。 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 提高純度。 加入聚陽(yáng)離子亞精胺(終濃度為 12.5 mmol/L) 。 DNA的分子結(jié)構(gòu): 構(gòu)型影響酶活，某些酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性DNA的高許多倍，最高可達(dá)20倍。 側(cè)翼序列：a 大多限制酶只對(duì)兩側(cè)存在側(cè)翼序列的識(shí)別序列起作用，如EcoRI不能對(duì)G

8、AATTC作用，而可作用于ATGAATTCGC。 b 一些限制酶，對(duì)不同具有不同側(cè)翼序列的限制位點(diǎn)的切割效率不同甚至有些位點(diǎn)很難被切，如NarI、NaeI、SacII以及XmaIII等。 甲基化程度：識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化影響酶活。 正常大腸桿菌有兩種使特定核苷酸甲基化的酶：dam甲基化酶，催化GATC中A的甲基化；dcm甲基化酶，催化CCATGG中內(nèi)部的C甲基化。因此，從正常大腸桿菌中分離的質(zhì)粒，能被限制酶局部甚至不被消化。 解決途徑：a 使用缺失甲基化酶的菌株制備質(zhì)粒DNA； b 嘗試同裂酶。 酶切反應(yīng)的溫度：不同的限制酶，具不同的最適溫度，低或高于最適溫度影響酶活，甚至完全失活。多

9、數(shù)限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37，有的低于37 ，如SmaI 25 、ApaI 30 ；有些則高于37 ，如MaeI 45 、BelI 50 、MaeIII 55 ，BstEII 60 、TaqI 65 等。 反應(yīng)的緩沖液：標(biāo)準(zhǔn)緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCl、-巰基乙醇或二硫蘇糖醇DTT以及牛血清白蛋白（BSA）等。 陽(yáng)離子: 酶活性的正常發(fā)揮需要二價(jià)陽(yáng)離子，通常Mg2+。不正確的Na或Mg2+濃度會(huì)降低酶活，還可導(dǎo)致識(shí)別序列特異性的改變。部分酶對(duì)Na +或K+ 變化十分敏感，而另一部分酶可適應(yīng)較廣變幅的離子強(qiáng)度。 緩沖系統(tǒng): TrisHCl（偶用TrisAc）, 使反應(yīng)混合物

10、的pH恒定在酶活性所要求的最佳值。絕大多數(shù)限制酶的最佳pH為7.4。 巰基試劑: 抗氧化，保持酶的穩(wěn)定性。 限制酶的Star活性：在特定條件下，某些酶在非識(shí)別序列處切割DNA的現(xiàn)象稱為Star活性。Star活性因限制酶種類、DNA和反應(yīng)條件的不同而不同：高濃度酶、高濃度甘油、低離子強(qiáng)度、Mn2+取代Mg2+ 或高pH。幾乎所有限制酶都具有Star活性，易產(chǎn)生Star活性的限制酶見p26。 解決途徑：盡量避免，即使是降低酶活性。 DNA分子的片段化 1）單酶切 用一種限制酶切割DNA分子。環(huán)狀DNA完全酶切，產(chǎn)生的片段數(shù)是限制酶識(shí)別序列數(shù)。線形DNA完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的片段數(shù)限制酶識(shí)別序列數(shù)加

11、1。 底物 + 緩沖液 + H2O（酶活性/總體積往往為1U/20微升）。完全酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像。 2）雙酶切 用兩種不同的限制酶切割DNA分子。 無(wú)論環(huán)狀, 還是線形分子，經(jīng)雙酶切所產(chǎn)生的DNA片段的兩個(gè)末端不同（同尾酶切割除外）。環(huán)狀DNA完全酶切，產(chǎn)生的片段數(shù)是兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)之和。線形DNA完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的片段數(shù)是兩種限制酶識(shí)別序列數(shù)之和加1。 反應(yīng)條件相同或相近: 可用同一緩沖系統(tǒng)，同時(shí)進(jìn)行雙酶切。完全酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像。反應(yīng)條件不同: a 不同溫度時(shí)，先低溫后高溫； b 不同鹽濃度時(shí)，先低鹽，后再高鹽； c 反應(yīng)系統(tǒng)相差很大時(shí)，第一種酶切割

12、 后，用酚、酚-氯仿和氯仿抽提，乙醇沉淀 DNA（或電泳分離），再用第二反應(yīng)系統(tǒng)， 進(jìn)行第二酶切。 3）部分（不完全）酶切 對(duì)DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的切割。 原因：底物純度低、識(shí)別序列甲基化、酶量不足、反應(yīng)體系和溫度不適宜、反應(yīng)時(shí)間不足。 結(jié)果：影響欲獲得DNA片段的得率。 用途：根據(jù)DNA重組的需要，專門創(chuàng)造部分酶切的條件，以獲得所需DNA片段；DNA分子作圖。A：完全酶切；B：部分酶切 DNA的限制性圖譜 DNA分子上限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列分布圖稱限制性圖譜（restriction map），或物理圖譜（physical map），見圖。 限制性圖譜可以是所有限制酶、也可

13、以是部分限制酶的識(shí)別序列分布圖。限制性圖譜是基因工程工作者設(shè)計(jì)DNA重組的重要依據(jù)。 對(duì)于未測(cè)定序列的DNA分子來說，可用下面的一些方法繪制出它的限制性圖譜。 1）雙酶切法（自學(xué)） 2）部分酶切法（自學(xué)） 3）末端標(biāo)記部分酶切法 E P 4）Bal 31逐步切割法 Bal 31 是一種核酸酶，能從DNA分子的兩斷逐個(gè)切割核苷酸。先用此酶進(jìn)行不同時(shí)間的切割，再用相應(yīng)的限制酶（如EcoRI）完全酶切，根據(jù)電泳結(jié)果得出限制性圖譜。3.2 DNA連接酶（ligase）3.2.1 連接酶的功能 1）缺刻修復(fù) 2）連接兩個(gè)DNA分子We usually use T4 ligase in joining D

14、NA fragments including Sticky and blunt ends. Mechanism: ligation takes place between 5-P and 3-OH3.2.2 Cloning strategy Ligating blunt endsIt is very difficult to join sticky ends of DNA. Under the higher temperature (22) condition, large amount of substrates and enzyme should be used to in

15、crease the chances of the ends of the molecules coming together in the correct way. ligating sticky endsIt is very easily to join sticky ends of DNA because of hydrogen bunds formation between base pairs, the temperature can be at 16. So we should try to get sticky ends in gene cloning. 3.2.

16、2.3 Other ways to obtain sticky ends1)Add linkers(連接體) to blunt endsLinker: A short, sequence-known, synthetic ds-DNA with restriction site and blunt ends2) Add adaptors （銜接頭 ） to blunt endsadaptor: A short, sequence-known, synthetic oligaonucleotides （寡核苷酸） with sticky ends in which restriction sit

17、e exists. Directional cloning (定向克隆) It is very important to keep correct direction between the insert and linear vector, as the cloned gene must be placed downstream of promoter in correct direction.PromoterTerminatorAUG UAA deletion GATCCGGATCCG GCCTAGGCCTAG result I GATCCGGATCCG GCCTAGGCC

18、TAG result IIGATCCG GATCCG GCCTAG GCCTAG BmaHI BmaHIInsertVectorInsertInsertVectorVector1) Non directional cloning: ligation between blunt ends, one RE digestion products GATCCG CTAGGC result III GATCCG GATCCG GCCTAG GCCTAG BmaHI BmaHIInsertVectorVectorSelf ligation of vectorHow to avoid self ligati

19、on of vector ?Deletion of 5-P of linear vector with BAP/CIP is a usual methodAATTCG AATTCG GCCTAG GCCTAG EcoRI BmaHI EcoRI BmaHI GATCCGAATTCG GCTTAAGCCTAG EcoRI BmaHI 2) Directional cloning: ligation between two RE digestion products Directional cloningInsertInsertVectorVector1)Nucleases （核酸酶）: cut,

20、 shorten or degrade nucleic acid, such as Bal31, ExonucleaseIII, DNaseI, nucleaseS1.2)Polymerase（聚合酶）: make copies of nucleic acid, such as DNA pol.I, RTase, RNA pol.3)Modifying enzymes（修飾酶）: remove or add chemical groups, such as BAP/CIP, polynucleotide kinase, terminal trasferase4)Topoisomerases（拓

21、撲異構(gòu)酶）: introduce or remove supercoils from covalently closed circular DNA (cccDNA)3.3 其他酶3.3.1 Nucleaes1） Exonuclease （核酸外切酶） Bal31 Exonuclease III2） endonuclease （內(nèi)切酶） DNase I S1 nuclease 5-3 Exonuclease Activity3-5 Exonuclease ActivityDNA Polymerase Activity3.3.2 DNA Polymerase （聚合酶） I1） Alkaline

22、Phosphatase （堿性磷酸酶）: BAP/CIP3.3.3 Modifying （修飾） enzymes2） Polynucleotide kinase （多聚核苷酸激酶） 3） Terminal deoxynucleotidyl transferase （末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶）3.3.4 Topoisomerases （拓?fù)洚悩?gòu)酶） Introduce or remove supercoils from covalently closed circular DNA (cccDNA), because it can recognize, cleave and religase the

23、 5 CCCTT3 motif in the deluxe DNA. Using these properties, a ligase-free TOPO Cloning System has been developed for about 10 years. Joining molecules with ligase requires an overnight incubation. However topoisomerase-mediated ligation occurs in 5 min. 1 名詞解釋 限制性核酸內(nèi)切酶；同裂酶；同尾酶；限制性核酸內(nèi)切酶星活性；限制性圖譜；平末端；粘

24、性末端；銜接頭；連接子 2 簡(jiǎn)要回答下列問題 1）基因工程中常用的酶有哪些？各有何的用途？ 2）何謂定向克??？如何進(jìn)行？ 3）說明限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生Star活性的原因及其克服措施。 復(fù)習(xí)思考題基因工程基因工程1 基因工程概論2 天然DNA的制備3 分子克隆工具酶4 分子克隆載體5 表達(dá)載體 6 PCR技術(shù)及其應(yīng)用 7 基因文庫(kù)的構(gòu)建 8 基因克隆的篩選策略 10 細(xì)菌基因工程 11 酵母基因工程 12 植物基因工程 13動(dòng)物基因工程 14 基因工程的安全9 轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)3 分子克隆工具酶3.1 限制性核酸內(nèi)切酶與DNA切割 概念： （restriction endonuclease）一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶(endo-d