核酸分子雜交ppt課件

1、核酸分子雜交核酸分子雜交定義定義 具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么締合成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸分子雜交。種類種類按反響支持物可分為固相雜交和液相雜交兩種：固相雜交運(yùn)用較廣，包括Southern blot、Northern blot 、Spot blot、in situ hybridization等。DNA HybridizationDe- and re-nature DNA DS using temperature variation一一. 核酸探針制備及標(biāo)志核酸探針制備及標(biāo)志v核酸探針probe是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的知核酸片段，因此可檢測(cè)樣品中特定的

2、基因序列。探針探針v根據(jù)核酸探針的來源及性質(zhì)有雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈RNA和人工合成的寡核苷酸探針等。用于分子雜交的核酸探針均須進(jìn)展標(biāo)志，帶有示蹤物，與靶基因雜交后，才干檢測(cè)顯示出雜交體信號(hào)。標(biāo)志物有放射性同位素和非放射性同位素兩大類。3H、35S和32P是三種較常用的放射性同位素標(biāo)志物，非放射性同位素標(biāo)志物較常用的是生物素biotin、地高辛digoxigenin，DIG和熒光素等。(一一)缺口平移標(biāo)志法缺口平移標(biāo)志法Nick translationv原理原理v在未標(biāo)志的在未標(biāo)志的DNA探針溶液中參與一定量的胰探針溶液中參與一定量的胰DNA酶酶DNase，DNA聚合酶聚合酶和標(biāo)志的三磷

3、酸核苷。和標(biāo)志的三磷酸核苷。DNase在在DNA雙鏈上隨機(jī)切開假設(shè)干個(gè)帶有雙鏈上隨機(jī)切開假設(shè)干個(gè)帶有3-OH末端末端的單鏈缺口，而的單鏈缺口，而DNA聚合酶聚合酶發(fā)揚(yáng)發(fā)揚(yáng)53核酸外切酶活性從核酸外切酶活性從5-末端末端標(biāo)志標(biāo)志v切除單核苷酸；同時(shí)又具有從53的聚協(xié)作用，將標(biāo)志的三磷酸核苷按53方向重新修補(bǔ)缺口，此新合成DNA的兩條鏈均勻地被摻人標(biāo)志物。該法適宜于各種環(huán)狀或線性雙鏈DNA探針標(biāo)志。標(biāo)志標(biāo)志v試劑試劑v1. 10缺口平移緩沖液缺口平移緩沖液v0.5 mol/L Tris-Cl(pH7.2v v0.1 mol/L MgSO4v v1.0 mmol/L 二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇(DTT)v

4、 v500 g/ml 牛血潔白蛋白牛血潔白蛋白(BSA)v 標(biāo)志標(biāo)志v2.未標(biāo)志脫氧三磷酸核苷dNTP溶液：dTTP、dCTP、dGTP溶于50mmol/LTris-Cl(pH7.2)，終濃度為20mmol/L。v3.DNase10ng/ml：溶于含50g/mlBSA、1mmol/LDTT、50%V/V乙二醇的溶液。v4.DNA聚合酶5U/l：溶于50mmol/LTris-Cl(pH7.2)。v5.-32PdATP：3000Ci/mmol、10Ci/l。操作步驟操作步驟v1.加樣：冰浴下依次參與以下試劑并混勻：v10缺口平移緩沖液2.5lv未標(biāo)志的dNTP混合液1.0lvDNA0.51g)5.

5、0lv-32PdATP5.0lvDNase振蕩混勻2.5lvDNA聚合酶振蕩混勻0.5lv雙蒸去離子水至體積25l操作步驟操作步驟v2.反響：于1416水浴23小時(shí)。加1l0.5mol/LEDTApH8.0)終止反響。v3.分別：標(biāo)志終了的反響液加至TE緩沖液平衡的SephadexG-50柱上柱床體積為0.730mm。加樣終了后，用TE緩沖液洗脫，分管搜集洗脫液，每管約200l。再每管取5l點(diǎn)樣于濾紙上液閃計(jì)數(shù)。主峰為純化的標(biāo)志探針，尾峰為未被結(jié)合的游離標(biāo)志核苷酸。將主峰部分搜集，20儲(chǔ)存。v操作步驟操作步驟v4.結(jié)合率的計(jì)算：vv主峰計(jì)數(shù)CPMv結(jié)合率=x100%v主峰計(jì)數(shù)CPM+尾峰計(jì)數(shù)C

6、PMvv普通結(jié)合率在2030%。二二5末端標(biāo)志法末端標(biāo)志法v原理vDNA5末端的磷酸根，用堿性磷酸酶去磷酸化，再用T4多核苷酸激酶將-32PATP的-32P轉(zhuǎn)移到DNA5端的羥基上。試劑試劑v1.5T4多核苷酸激酶緩沖液v0.5mol/LTris-Cl(pH7.6v0.1mol/LMgCl2v50mmol/LDTTv1mmol/L精脒Spermidinev2.T4多核苷酸激酶溶液1U/lv3.堿性磷酸酶25U/ml操作步驟操作步驟v1.DNA去磷酸化：在Eppendorf管內(nèi)加5lDNA，25l50mmol/LTris-Cl(pH8.0和20l堿性磷酸酶，37反響3060分鐘。然后用酸變性堿性

7、磷酸酶，用乙醚提取。再加1/10體積3.0mol/L醋酸鈉，用乙醇沉淀。v2.將0.1mCi-32PATP放入小離心管，凍干。v3.轉(zhuǎn)32P到DNA上：在含有-32PATP的小離心管內(nèi)，依次參與38l去磷酸的DNA，10l多核苷酸激酶緩沖液，3l多核苷酸激酶，在37反響3040分鐘。v4.分別：加等體積飽和酚，離心510分鐘后，取上清液到另一個(gè)小離心管內(nèi)，再加500l乙醚，混勻，離心，棄去上層含有殘留酚溶液，加1/10體積3.0mol/L醋酸鈉。然后加雙倍體積冷乙醇混合在-70中15分鐘，或-20中2小時(shí)，沉淀DNA。操作步驟三隨機(jī)引物標(biāo)志法三隨機(jī)引物標(biāo)志法v原理原理v隨機(jī)引物是指含有各種能夠

8、陳列組合順序的寡核隨機(jī)引物是指含有各種能夠陳列組合順序的寡核苷酸混合物。目前實(shí)驗(yàn)室中常用的隨機(jī)引物多是苷酸混合物。目前實(shí)驗(yàn)室中常用的隨機(jī)引物多是人工合成，其長度為人工合成，其長度為6個(gè)核苷酸。標(biāo)志的方法是個(gè)核苷酸。標(biāo)志的方法是將雙鏈將雙鏈DNA變性成單鏈變性成單鏈DNA，再與隨機(jī)引物退，再與隨機(jī)引物退火雜交，在四種脫氧三磷酸核苷存在下，由大火雜交，在四種脫氧三磷酸核苷存在下，由大DNA聚合酶大片段聚合酶大片段Klenow片段催化，從片段催化，從引物的引物的3末端開場(chǎng)按末端開場(chǎng)按53方向合成與模板方向合成與模板DNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNA鏈，如有鏈，如有-32PdNTP或其或其他示蹤物的摻人，就可產(chǎn)

9、生標(biāo)志的他示蹤物的摻人，就可產(chǎn)生標(biāo)志的DNA探針。探針。 原理原理v隨機(jī)引物是指含有各種能夠陳列組合順序的寡核苷酸混合物。目前實(shí)驗(yàn)室中常用的隨機(jī)引物多是人工合成，其長度為6個(gè)核苷酸。標(biāo)志的方法是將雙鏈DNA變性成單鏈DNA，再與隨機(jī)引物退火雜交，在四種脫氧三磷酸核苷存在下，由大DNA聚合酶大片段Klenow片段催化，從引物的3末端開場(chǎng)按53方向合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈，如有-32PdNTP或其他示蹤物的摻人，就可產(chǎn)生標(biāo)志的DNA探針。操作步驟操作步驟v1.在Eppendorf管中，將TE溶解的30100ng純化的雙鏈DNA與15ng隨機(jī)引物混合總體積不超越14l，置沸水中變性3分鐘，再立

10、刻置冰浴中冷卻；v2.迅速離心10秒，使溶液聚集于試管底部，冰浴中放置；3.冰浴中在一微量離心管中依次參與以下試劑并混勻：10Klenow緩沖液2.5l10dNTP2.5lKlenow片段1.0l-32PdCTP5.0l4.將上述混合液參與到變性模板DNA隨機(jī)引物溶液中。5室溫放置3小時(shí)以上。操作步驟v6加1l0.5mol/LEDTApH8.0)終止反響，并用TE緩沖液稀釋反響液至100l，20保管備用。操作步驟四光化生物素法四光化生物素法v原理v光化生物素是一種化學(xué)合成的生物素衍生物，分子中含有可光照活化的疊氮代硝苯基，生成活潑N基團(tuán)，后者易與DNA或RNA中的伯胺基發(fā)生結(jié)合反響，生成光化生

11、物素標(biāo)志核酸探針。 v資料資料v1. 光化生物素：在暗室中用滅菌雙蒸水配成光化生物素：在暗室中用滅菌雙蒸水配成1mg/ml，分裝后，避光下，分裝后，避光下20可穩(wěn)可穩(wěn)定保管定保管4 6個(gè)月。個(gè)月。v2. 正丁醇或仲丁醇正丁醇或仲丁醇v3. 特種光源：特種光源： LYQ12-100鹵鎢燈鹵鎢燈操作步驟操作步驟v1.暗室平安燈下，在Eppendorf管中參與125g待標(biāo)志核酸0.51.0g/mlDNA或RNA，兩倍量的光化生物素即250g，補(bǔ)水至50l。將反響管敞開插入冰模中，距鹵鎢燈光源10cm，強(qiáng)光照射30分鐘。加100lTE緩沖液。以后操作在正常光線下。v2.加100l正丁醇或仲丁醇，抽提兩

12、次，去上層正丁醇；v3.加1/10體積3mol/L醋酸鈉pH5.2和2倍體積冷無水乙醇，混勻后置20過夜。v4.離心的沉淀經(jīng)枯燥后，溶于適量的0.1mol/LEDTA或滅菌雙蒸水中，濃度為50g/ml，分裝后20避光保管。操作步驟五五DIG標(biāo)志探針標(biāo)志探針vDIG標(biāo)志是德國BoehringerMannheim公司開展的一種非放射性標(biāo)志方法。Digoxigenin-11dUTP可以經(jīng)過隨機(jī)引物標(biāo)志結(jié)合到DNA探針或經(jīng)過DNA體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)志到RNA探針，或經(jīng)過3尾端標(biāo)志結(jié)合到寡聚核苷酸探針。然后與抗地高辛抗體antidigonigeninalkalinephosphatase進(jìn)展免疫反響，經(jīng)過化學(xué)呈

13、色檢測(cè)。DIG標(biāo)志法與前述同位素酶促標(biāo)志法根本一樣。二二. 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交v原理原理v將將DNA或或RNA變性后直接點(diǎn)樣吸附于固相支持變性后直接點(diǎn)樣吸附于固相支持濾膜上，然后用標(biāo)志探針與之雜交，洗滌去除未濾膜上，然后用標(biāo)志探針與之雜交，洗滌去除未反響探針，采用放射自顯影或顯色反響檢測(cè)顯示反響探針，采用放射自顯影或顯色反響檢測(cè)顯示雜交信號(hào)，分析結(jié)果。雜交信號(hào)，分析結(jié)果。v本節(jié)主要引見用本節(jié)主要引見用-32 P標(biāo)志標(biāo)志DNA探針及光化生探針及光化生物素標(biāo)志物素標(biāo)志DNA探針檢測(cè)探針檢測(cè)DNA與與RNA的斑點(diǎn)雜交的斑點(diǎn)雜交方法。方法。資料資料v1器材v同位素探測(cè)儀v自動(dòng)光密度掃描儀v真空抽濾加樣器

14、vX光膠片盒帶增感屏2. 試劑試劑v20SSC3mol/LNaCl、0.3mol/L檸檬酸三鈉：稱取175.32gNaCl，加700ml雙蒸水，充分溶解后，加88.2g檸檬酸三鈉，溶解后加雙蒸水至1000ml，8磅高壓滅菌15分鐘。v去離子甲酰胺：稱取11g離子交換樹脂Bio-BadAG501-X8，2025目與110ml甲酰胺混合，室溫下攪拌30分鐘，用Waterman濾紙過濾2次，分裝后20保管。v胰腺癌飲食：yixianaijx/a/yixianaiyingshi/v硫酸葡聚糖1mg/ml：稱取1mg硫酸葡聚糖干粉，溶于1ml滅菌水，20保管。v50Denhardt溶液1%BSA、1%P

15、VP-40、1%Ficoll-400：分別稱取1gBSA，1gPVP-40聚乙烯吡咯烷酮，1gFicoll-400水溶性聚蔗糖，用少量雙蒸水溶解混合，加雙蒸水至100ml。過濾除菌，20保管。2. 試劑v變性鮭魚精DNA10mg/ml：稱取鮭魚精DNASigma，型，鈉鹽10mg放入滅菌管中，參與100mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA緩沖液1ml，用超聲波處置至液體透亮，完全溶解，分裝后20保管。臨用前置沸水浴中3分鐘，然后迅速在冰浴中冷卻。預(yù)雜交液中應(yīng)含100g/mlDNA經(jīng)變性并打斷的鮭魚精DNA。v 卵 白 素 - 堿 性 磷 酸 酶 A v i d i n - A

16、K P ，100U/100l：以0.4%TritonX-100PBS液配制。運(yùn)用液中Avidin-AKP濃度為12U/1ml。2. 試劑v底物緩沖液：100mmol/LTris-ClpH9.5、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCL2。v底物顯色液v150mg/mlBCIP：10mgBCIP溶于200l二甲基酰胺。v275mg/mlNBT：15mgNBT溶于200l70%二甲基酰胺H2O配制。v3底物顯色液：5ml底物緩沖液+10lBCIP+10lNBT2. 試劑操作步驟操作步驟v-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交v1.樣膜的制備v(1)、核酸樣品的預(yù)變性v所取DNA及RNA樣品的量視情況

17、而定，普通可加1020g。v1DNA樣品：樣品DNA溶于水或TE緩沖液，置沸水浴510分鐘，并于冰浴中迅速冷卻，使其變性。v2RNA樣品：在Eppendorf管參與以下試劑：vRNA樣品10lv20SSC2lv甲醛7lv甲酰胺20lv混勻置68溫育15分鐘，并迅速入冰浴中至少5分鐘。操作步驟v(2)尼龍膜的預(yù)處置：戴上干凈手套，取尼龍膜按需求剪成適宜大小，并剪掉一角作為點(diǎn)樣順序標(biāo)志。如采用手工點(diǎn)樣，用鉛筆在尼龍膜上按0.81cm2的面積標(biāo)上小格。用蒸餾水浸濕，再浸入6SSC溶液中至少30分鐘，將膜取出自然涼干后待用。操作步驟(3)點(diǎn)樣點(diǎn)樣v可根據(jù)情況選用手工直接點(diǎn)樣或用真空抽濾加樣器點(diǎn)樣。點(diǎn)樣

18、點(diǎn)樣v1)手工直接點(diǎn)樣：用微量移液器將經(jīng)變性處置的核酸樣品依次點(diǎn)到尼龍膜的標(biāo)志點(diǎn)上。斑點(diǎn)直徑不要過大，應(yīng)控制在0.5cm2以內(nèi)。單個(gè)樣品分少量多次點(diǎn)樣，邊點(diǎn)樣邊風(fēng)干。點(diǎn)樣點(diǎn)樣v2)斑點(diǎn)狹縫真空抽濾加樣器點(diǎn)樣：常規(guī)方法清洗加樣器后，用0.1mol/LNaOH清洗點(diǎn)樣器，滅菌三蒸水充分沖洗，如為RNA樣品那么還運(yùn)用DEPC處置的水充分沖洗。將尼龍膜潮濕后覆蓋在加樣器支持墊上或?yàn)轭A(yù)先潮濕的濾紙，小心排除氣泡，尼龍膜覆蓋不到的部分需用Parafilm膜封鎖；重新安裝好加樣器，接通真空泵。加樣孔內(nèi)加滿10SSC，真空抽濾至一切液體被抽干；封鎖真空泵，然后反復(fù)抽濾一次。點(diǎn)樣點(diǎn)樣v上述經(jīng)預(yù)變性處置的樣品中參

19、與2倍體積20SSC，分別加至各孔，真空抽濾。待全部液體抽干后，再加10SSC抽濾兩次。待10SSC抽干后再維持真空5分鐘，使尼龍膜枯燥。點(diǎn)樣點(diǎn)樣v(4)固定：點(diǎn)樣后的樣膜，置濾紙上，室溫自然枯燥，然后80烘烤2小時(shí)固定核酸樣品。固定的樣膜封存于塑料袋內(nèi)待用20可保管假設(shè)干月。2. 預(yù)雜交預(yù)雜交v(1)配制預(yù)雜交液：終濃度為6SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、0.5mg/ml鮭魚精DNA和0.5%SDS。v(2)將封存樣膜的塑料袋剪一斜角開口，加少量的2SSC使其潮濕，棄余液。按150200l/cm2膜，參與預(yù)雜交液，去除袋內(nèi)氣泡，熔封塑料袋斜角開口處。將此塑料袋置恒溫?fù)u床或雜

20、交爐中，42溫育24小時(shí)。3. 雜交雜交v (1)探針變性：-32P標(biāo)志的探針如為雙鏈DNA，那么需經(jīng)變性處置。將標(biāo)志好的探針置沸水浴中5分鐘，然后迅速置冰浴中。v (2)配制雜交液：終濃度為6SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、0.1mg/ml鮭魚精DNA、0.5%SDS和放射性同位素探針0.5ng/l。雜交雜交v(3)雜交：從水浴中取出塑料袋，剪去一角，棄預(yù)雜交液，參與雜交液按80l/cm2膜及-32P標(biāo)志探針。小心排除氣泡，重新封好口。為防止污染，應(yīng)將塑料袋外再套另一塑料袋。將雜交袋置恒溫?fù)u床或雜交爐中，42溫育1620小時(shí)。4. 洗膜洗膜v雜交溫育終了后，剪開雜交袋一角，

21、將雜交液倒入放射性廢物容器中，剪開袋取出膜，放進(jìn)裝有2SSC0.1%SDS的盤中，室溫?fù)u擺漂洗5分鐘。根據(jù)需求選擇不同方法洗膜，去除非特異性的同位素。洗膜洗膜v(1)高嚴(yán)謹(jǐn)性漂洗：依次按以下條件漂洗：v2SSC0.1%SDS室溫，215分鐘；v0.1SSC0.1%SDS室溫，215分鐘；v0.1SSC0.1%SDS55，215分鐘；洗膜洗膜v(2)低嚴(yán)謹(jǐn)性漂洗：依次按以下條件漂洗：v6SSC0.1%SDS室溫，215分鐘；v2SSC0.1%SDS室溫，215分鐘；v1SSC0.1%SDS55，215分鐘。5. 放射性自顯影放射性自顯影v樣膜經(jīng)漂洗后，置干凈濾紙上，吸去膜上多余水分，外面裹一層保

22、險(xiǎn)膜。暗室平安燈下，在膠盒中壓上2張X光膠片，樣膜上下各1張，蓋上膠片盒80放射自顯影。時(shí)間視雜交強(qiáng)度而定，24小時(shí)10天不等。取出膠片盒，恢復(fù)至室溫。按常規(guī)沖洗X光片：顯影15分鐘,停顯1分鐘,定影5分鐘,流動(dòng)水沖洗10分鐘，自然枯燥。6. 結(jié)果察看結(jié)果察看v根據(jù)曝光點(diǎn)或狹縫的有無、強(qiáng)弱，可以斷定目的基因的有無及量的多少。利用自動(dòng)灰度掃描儀掃描曝光點(diǎn)狹縫，計(jì)算積分光密度值，可以進(jìn)展半定量分析。二光敏生物素標(biāo)志二光敏生物素標(biāo)志DNA探針的點(diǎn)雜交探針的點(diǎn)雜交v1.樣膜的制備v按-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)展。v2.預(yù)雜交v按-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)展。v預(yù)雜交液中各組份的

23、終濃度為：5SSC、50%去離子甲酰胺、5Denhardt液、50mmol/LNa2HPO4pH7.0、5mmol/LEDTA、0.5mg/ml鮭魚精DNA。3. 雜交雜交v(1)探針變性：將標(biāo)志的光化生物素DNA探針參與0.5mlEppendorf管中，置沸水中510分鐘，立刻置于冰浴中，使堅(jiān)持單鏈形狀。雜交雜交v(2)配制雜交液：各組分終濃度為5SSC、50%去離子甲酰胺、1Denhardt液、20mmol/LNa2HPO4pH7.0、5%硫酸葡聚糖、0.1mg/ml鮭魚精DNA、光敏生物素標(biāo)志DNA探針20100ng/ml組成。雜交雜交v(3)雜交：參見-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交。

24、4. 洗膜洗膜v取出樣膜置含2SSC0.1%SDS溶液中漂洗5分鐘。再按以下條件洗膜：2SSC0.1%SDS100ml，室溫，320分鐘；0.1SSC0.1%SDS100ml，65，330分鐘；將樣膜置干凈濾紙上，室溫自然枯燥，封入塑料袋內(nèi)不立刻顯色可存放于20至少1個(gè)月。5. 顯色顯色v(1)封鎖：將3%BSA溶液參與塑料袋內(nèi)，于42溫育封鎖1小時(shí)。顯色顯色v(2)酶聯(lián)顯色反響：棄封鎖液，再參與適當(dāng)稀釋的Avidin-AKP，置室溫1530分鐘，不時(shí)細(xì)微振蕩。隨后依次按以下條件洗膜：100mmol/LTris-HClpH7.5、1mol/LNaCl；100mmol/LTris-HClpH9.

25、5、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCl2。將膜轉(zhuǎn)入新塑料袋中，參與新配制的底物顯色液，在暗環(huán)境中室溫下顯色，時(shí)間1560分鐘。6. 結(jié)果斷定結(jié)果斷定v出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)狹縫者為陽性，未著色為陰性。根據(jù)著色的深淺可以斷定目的基因的多少。三三. Sourthern印跡雜交印跡雜交v原理vSourthern印跡雜交是分析DNA的一種方法，從細(xì)胞或組織中提取高分子量的DNA，用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分別所得片段，從凝膠中按原來位置和順序吸印轉(zhuǎn)移到固相支持膜硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后再與同位素或非同位素標(biāo)志探針雜交，最后經(jīng)放射自顯影或顯色反響進(jìn)展檢測(cè)。v以-32P標(biāo)

26、志DNA探針檢測(cè)DNA為例，引見Sourthern印跡雜交方法。資料資料v一器材v同位素探測(cè)儀v自動(dòng)光密度掃描儀v真空核酸轉(zhuǎn)移安裝v紫外照相安裝vX光膠片盒帶增感屏vv二試劑及配制v1.0.2mol/LHClv2.變性液:0.5mol/LNaOHv1.5mol/LNaClv3.中和液:1mol/LTris-ClpH7.4v1.5mol/LNaClv4、轉(zhuǎn)移液:20SSC；或20SSPEv5、1mol/LTris-ClpH7.51.5mol/LNaCl操作步驟操作步驟v一瓊脂糖凝膠電泳分別基因組DNA限制性酶切片段v1、在滅菌Eppendorf管中依次參與以下試劑并混勻以常用的30l反響體積為例

27、：v0.5g/l基因組DNA20lv雙蒸去離子水5lv10緩沖液3lv限制性內(nèi)切酶10U/l2lv2、12000g離心數(shù)秒，使管壁上的液珠離心至管底，以保證反響體系體積準(zhǔn)確。v3、置37水浴保溫36小時(shí)。v4、參與1/5體積的0.5mol/LEDTA終止反響。v5、依常規(guī)方法進(jìn)展DNA的瓊脂糖凝膠電泳。v二DNA的轉(zhuǎn)移與固定v基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖凝膠電泳后，可將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至固相支持膜上，方法主要有毛細(xì)管洗脫法及真空轉(zhuǎn)移法。v1、毛細(xì)管洗脫法v1電泳終了后照相，然后切去凝膠的邊角作為標(biāo)志。v2將膠置于0.2mol/LHCl中處置10分鐘，假設(shè)檢測(cè)的DNA片段1kb，可適

28、當(dāng)延伸時(shí)間1020分鐘。當(dāng)膠中溴酚藍(lán)由藍(lán)轉(zhuǎn)成桔黃時(shí)，闡明膠已處置完成。v3棄去HCl溶液，用去離子水漂洗2次。隨后浸泡于數(shù)倍體積的變性液中1545分鐘后此時(shí)溴酚藍(lán)重新變?yōu)樗{(lán)色，換用中和液處置1530分鐘。v4取一瓷盤，參與轉(zhuǎn)移液，上置一塊略大于凝膠的玻璃板作為平臺(tái)，玻璃板外表鋪一張新華二號(hào)濾紙，濾紙的兩邊浸沒在轉(zhuǎn)移液中，去除玻璃板與濾紙之間的一切大小氣泡。v5根據(jù)膠的大小載剪固相支持膜及濾紙片35張，同樣剪去膜的一角作標(biāo)志也可用鉛筆在膜下端寫上有關(guān)資料，如時(shí)間、樣品及所用酶等。v6將膜平鋪在去離子水外表，直到濾膜從下到上濕透為止，然后將其轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中，至少5分鐘。操作時(shí)戴手套，用平頭鑷。v7將

29、經(jīng)轉(zhuǎn)移液浸泡的濾紙片12張鋪到轉(zhuǎn)移臺(tái)上，驅(qū)逐氣泡。倒上少許轉(zhuǎn)移液，用大小適宜的薄塑料板將膠從中和液中托起，將加樣孔先接觸轉(zhuǎn)移臺(tái)，自一端起將膠滑放到濾紙上，留意不要留下氣泡。將浸泡好的膜放在膠上，使膜的上端對(duì)齊加樣孔。放上23層預(yù)先浸泡過轉(zhuǎn)移液的濾紙片，放上吸水紙堆至1015cm高，上面加一塊平板，然后壓上0.5kg左右的重物。v8轉(zhuǎn)移繼續(xù)824小時(shí)，每當(dāng)紙巾浸濕后改換新的紙巾。小片段轉(zhuǎn)移快，大片段轉(zhuǎn)移需求時(shí)間較長。v9轉(zhuǎn)移終了，移去吸水紙，用平頭鑷將膜取出，在6SSC溶液中浸泡濾膜5分鐘，用濾紙印吸干后，夾在兩層干凈濾紙片中，置于80烤0.52小時(shí)。封入塑料袋中保管備用。v2、真空轉(zhuǎn)移法v1安

30、裝真空轉(zhuǎn)移安裝v1)根據(jù)膠的大小做好塑料膜窗口，其大小略小于凝膠，每邊應(yīng)有310mm的重合，讓膠將窗口嚴(yán)密地封住。但不能大于10mm，否那么參與液體后，膠容易漂起來。v2)將多孔濾板安放在安裝的下槽內(nèi)，四邊套緊氣密圈，再放上塑料膜窗口。v3)將上框放上，壓住窗口塑料膜的四邊，夾緊四角上的鎖定夾。v2依次放上轉(zhuǎn)移膜及瓊脂糖凝膠v1)膜的預(yù)備：將硝酸纖維素膜或尼龍膜裁剪成每邊少于窗口邊緣0.51.0mm。v2)用水浸濕，再用20SSC漂浮轉(zhuǎn)移膜2030分鐘，尼龍膜可不預(yù)處置。v3)將膜放在窗口內(nèi)，務(wù)使每邊留下1mm左右的空隙。v4)用一張大小適宜的薄塑料片托住凝膠，將加樣孔與窗口對(duì)齊平放，然后使膠

31、滑落在膜上，覆蓋住窗口。v5)啟動(dòng)真空泵，使凝膠吸壓在膜和塑料窗口上，檢查密封效果。v3脫嘌呤處置：用巴氏吸管加0.2mol/LHCl于凝膠上，使覆蓋整個(gè)凝膠，使真空泵負(fù)壓在2030Mbar維持1020分鐘，至溴酚藍(lán)完全變色為止。吸去凝膠上面的HCl。v4變性處置：同法參與變性液覆蓋整塊凝膠，使真空泵負(fù)壓在2030Mbar維持1020分鐘，至溴酚藍(lán)顏色完全復(fù)原為止。吸去凝膠上面的變性液。v5中和處置：同法參與中和液覆蓋整塊凝膠，使真空泵負(fù)壓在2030Mbar維持1020分鐘，吸去凝膠上面的中和液。v6轉(zhuǎn)移：從凝膠中央小心參與20SSC溶液，直至覆蓋住整塊凝膠，液面最好達(dá)2倍凝膠的厚度。真空負(fù)壓

32、為5055Mbar，轉(zhuǎn)移時(shí)間按照凝膠的厚度、濃度而定，凝膠的厚度和濃度越高，所需時(shí)間越長，普通繼續(xù)轉(zhuǎn)移3060分鐘。v7固定：轉(zhuǎn)移終了，依次移去上框、剩余的20SSC、凝膠及真空墊圈，取出轉(zhuǎn)移膜，不要浸泡或沖洗，轉(zhuǎn)移面朝上放在濾紙上晾干。將膜夾在兩層濾紙中間，80干烤固定12小時(shí)，封入塑料袋中保管備用。v三預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影和結(jié)果分析v按-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)展。Diagnosis of Sickle-Cell Anemia四四. Northern印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)v原理vNorthern 印跡雜交的根本原理是將RNA樣品經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)展分別，再轉(zhuǎn)移

33、到尼龍膜等固相膜載體上，用放射性同位素標(biāo)志的DNA或RNA特異探針對(duì)固定于膜上的mRNA進(jìn)展雜交，洗膜去除非特異性雜交信號(hào)，經(jīng)放射自顯影，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)展分析。將雜交的mRNA在電泳中的遷移位置與規(guī)范分子量進(jìn)展比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小，對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱比較，可了解該基因表達(dá)mRNA的強(qiáng)弱。v以甲醛瓊脂糖變性膠電泳分別RNA，引見RNANorthern印跡雜交。v資料v一器材v同位素探測(cè)儀v自動(dòng)光密度掃描儀v真空核酸轉(zhuǎn)移v紫外照相安裝vX光膠片盒帶增感屏v二試劑及配制v1、5甲醛電泳緩沖液v0.1mol/L3-N-瑪琳N-morpholincpropane-sulfonicac

34、id，MOPSpH7.0v25mmol/LNaACv5mmol/LEDTApH8.0v將20.9gMOPS溶于800ml經(jīng)0.1%焦炭酸二乙脂DEPC處置的水中，加8.3ml3mol/L乙酸鈉，20ml0.5molEDTA(pH8.0)，用DEPC處置的水定容至1L，0.2m微孔濾膜過濾除菌，避光保管于4。溶液見光變?yōu)樯铧S色不能再用。v2、甲醛凝膠加樣緩沖液v50%甘油v1mmol/LEDTApH8.0)v0.25%溴酚藍(lán)v0.25%二甲苯青FFv用0.1%DEPC37處置過夜，高壓滅菌，保管于室溫。v3、溴化乙錠溶液v0.5g/ml溴化乙錠v0.1mol/L乙酸銨v方法v 一甲醛變性電泳分別

35、RNA樣品v1、電泳槽的無RNA酶處置：電泳槽用去污劑洗干凈，蒸餾水沖洗，無水乙醇漂洗干凈，3% H2O2處置10分鐘，最后用DEPC處置過的三蒸水沖洗數(shù)遍。v2、配制1%瓊脂糖變性膠：v5甲醛電泳緩沖液20mlv0.1%DEPC水80mlv瓊脂糖1gv加熱至膠完全溶化后，冷卻至60，參與5.4ml37%甲醛，混勻并置通風(fēng)櫥內(nèi)，將凝膠傾倒入電泳槽上，于室溫放置30分鐘或更長時(shí)間，使凝膠凝固。v3、RNA樣品處置v在Eppendorf管中參與以下試劑：vRNA樣品9lv5甲醛電泳緩沖液4lv甲醛7lv甲酰胺20lv總體積40l，混勻后65溫育15分鐘，并迅速置冰浴中至少5分鐘。5000g離心5秒

36、使管內(nèi)一切液體集中于管底。加4l甲醛凝膠加樣緩沖液混合待用。v4、電泳：制備的凝膠先預(yù)電泳5分鐘，再將樣品加至凝膠加樣孔中，同時(shí)參與知大小的RNA混合物作為分子量規(guī)范參照物，按34V/cm電壓進(jìn)展電泳。電泳過程中，每隔12小時(shí)，將正負(fù)極槽內(nèi)液體混合后繼續(xù)電泳。v5、電泳結(jié)果察看：電泳終了后溴酚藍(lán)遷移出約78cm，切下分子量規(guī)范參照物的凝膠條，浸入溴化乙錠溶液中染色3045分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照相，便于以后丈量照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的間隔。以RNA片段大小的對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移間隔作圖，繪制規(guī)范曲線，根據(jù)規(guī)范曲線計(jì)算雜交后所檢出的RNA分子的大小。v二變性RNA轉(zhuǎn)移至

37、尼龍膜v上述經(jīng)甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳分別的RNA樣品，應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，方法主要有毛細(xì)管洗脫法及真空轉(zhuǎn)移法。v1、毛細(xì)管洗脫法v1凝膠的預(yù)處置：將凝膠移至一個(gè)干烤過的平皿內(nèi)，將邊緣多余部分用眼科解剖刀切去，在加樣孔一側(cè)切去一角作凝膠方位標(biāo)志。并用經(jīng)DEPC處置的三蒸水淋洗數(shù)次，除去甲醛。v2取一瓷盤，參與20SSC溶液，上置一塊略大于凝膠的玻璃板作為平臺(tái)，玻璃板外表鋪一張新華二號(hào)濾紙，濾紙的兩邊浸沒在20SSC溶液中，去除玻璃板與濾紙之間的一切氣泡。v3把凝膠底向上翻轉(zhuǎn)覆蓋在濾紙上，去除二層之間出現(xiàn)的氣泡。用保鮮膜圍繞在凝膠周邊，但不覆蓋凝膠，作為屏障以阻止液體自池邊直接流至凝膠上方的紙巾

38、中。v4裁剪一張尼龍膜，其長與寬大于凝膠11.5cm，并剪下一角做記號(hào)以定濾膜方位。先將膜在20SSC中至少潤濕20分鐘，然后放置在凝膠外表上，二層之間不可有氣泡存在。v5將兩張與尼龍膜一樣大小經(jīng)20SSC溶液潤濕過的濾紙，覆蓋在尼龍膜上，去除氣泡。6把一疊約510cm高同濾紙大小一樣的吸水紙放置在濾紙上，在吸水紙上再放一塊玻璃板和約500g的重物。v7上述程序就緒，RNA轉(zhuǎn)移即開場(chǎng)進(jìn)展，需繼續(xù)1824小時(shí)。假設(shè)吸水紙過于潮濕，應(yīng)換新的吸水紙。v8轉(zhuǎn)移終了后，揭去凝膠上方的吸水紙和濾紙，取出尼龍膜，不用沖洗、浸泡，轉(zhuǎn)移面朝上置一張濾紙上晾干。將膜夾在兩張濾紙中間，80干烤固定12小時(shí)，封入塑料

39、袋中保管待用。v2、真空轉(zhuǎn)移法v1凝膠的預(yù)處置：詳細(xì)程序同毛細(xì)管洗脫法。v2真空轉(zhuǎn)移槽預(yù)處置：常規(guī)去污劑清洗，三蒸水漂洗數(shù)次，再用DEPC處置的三蒸水沖洗數(shù)次后備用。v3在轉(zhuǎn)移槽的支持網(wǎng)上置放經(jīng)2SSC潮濕過的新華二號(hào)濾膜二張，去除支持網(wǎng)與濾膜間的氣泡。v4裁剪一張尼龍膜，每邊應(yīng)比凝膠大11.5cm，于2SSC中浸泡20分鐘，平放在濾紙上，去除一切氣泡。v5選取適宜大小的真空墊圈每邊略小于凝膠11.5cm，覆蓋住尼龍膜，調(diào)整尼龍膜的位置，使其處于真空墊圈的中間。v6將凝膠放置到真空墊圈上，檢查凝膠四邊，要與墊圈嚴(yán)密重疊。排除一切氣泡。v7加上上框，固定真空墊圈。翻開真空泵，調(diào)整到613kPa的

40、壓力。v8小心參與20SSC溶液覆蓋凝膠，繼續(xù)轉(zhuǎn)移3小時(shí)。v9轉(zhuǎn)移終了，依次移去上框、剩余的20SSC、凝膠及真空墊圈，取出尼龍膜，不要浸泡或沖洗，轉(zhuǎn)移面朝上放在濾紙上晾干。將膜夾在兩層濾紙中間，80干烤固定12小時(shí)，封入塑料袋中保管待用。v三預(yù)雜交、雜交、洗膜和放射自顯影v按-32P標(biāo)志DNA探針的斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)展。v四分析結(jié)果：根據(jù)曝光顯示的條帶，對(duì)照RNA分子量規(guī)范參照物條帶的遷移間隔圖，即可查出凝膠電泳中相應(yīng)的RNA位置，從而知道基因轉(zhuǎn)錄的RNA的大小。利用自動(dòng)光密度掃描儀掃描曝光的條帶，計(jì)算條帶的積分光密度值，以內(nèi)參照RNA條帶的積分光密度為校正值，可以確定不同樣品基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)強(qiáng)度

41、。五五. 原位雜交原位雜交v原理v原位雜交insituhybridization,ISH是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù),也稱原位雜交組織化學(xué)insituhybridizationhistochemistry，ISSH。它是利用標(biāo)志的DNA或RNA為探針，在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異的DNA或RNA序列的雜交技術(shù)。其根本原理是含互補(bǔ)順序的標(biāo)志DNA或RNA片段即探針，v在適宜的條件下與細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA構(gòu)成穩(wěn)定的雜交體。根據(jù)所用的探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)志物能否能直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直

42、接法和間接法兩類。直接法指用放射性同位素、熒光素或一些酶標(biāo)志的探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸所構(gòu)成的雜交體可分別經(jīng)過放射自顯影、v熒光顯微術(shù)或顯色的酶促反響等直接檢測(cè)。間接法指用半抗原標(biāo)志探針，而探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸構(gòu)成的雜交體那么經(jīng)過免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原的定位間接地顯示。v本節(jié)主要引見用-32P標(biāo)志DNA探針檢測(cè)冰凍組織切片中DNA及以地高辛標(biāo)志DNA探針檢測(cè)石蠟包埋組織切片中DNA的原位雜交方法。v試劑試劑v 1、 0.2mol/L HCL：1.72ml濃濃HCL，加，加ddH2O至至100ml。v 2、0.2%Triton X-100 0.1mol/L PBS： 1000ml 0.1mol/

43、L PBS 液中參與液中參與Triton X-100 2ml，混勻，高壓滅菌。，混勻，高壓滅菌。v3、蛋白酶、蛋白酶K溶液溶液:v 1 mol/L Tris-HClpH 8.0 10mlv 0.5mol/L EDTA ( pH 8.0 10mlv 加滅菌水至加滅菌水至100mlv運(yùn)用前參與蛋白酶K儲(chǔ)存液0.5mg/ml，-20保管，使蛋白酶K的終濃度為1g/ml。v4、4%多聚甲醛0.1mol/LPBS(pH7.4)：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，參與500800ml0.1mol/LPBS(pH7.4，加熱至60左右，繼續(xù)攪拌使粉末完全溶解，常需滴加少許1mol/LNaOH才干使溶液清亮

44、，再加0.1mol/LPBS至1000ml，充分混勻。v5、預(yù)雜交液v50%去離子甲酰胺v2SSCv10%硫酸葡聚糖v5Denhardt溶液v0.5mg/ml變性鮭魚精DNAv6、-32P標(biāo)志的DNA探針v7、地高辛標(biāo)志的DNA探針v8、緩沖液：v順丁烯二酸馬來酸0.1mol/LvNaCL0.15mol/Lv用10mol/LNaOH將pH調(diào)至7.520，高壓滅菌后備用。v9、緩沖液v先制備阻斷劑儲(chǔ)存液；取試劑盒中阻斷劑按10%W/V)參與緩沖液，混勻，用微波爐加熱使其完全溶解，高壓消毒后4或-20保管。取上述10%的阻斷劑儲(chǔ)存液用緩沖液按1：10稀釋即制成緩沖液。v10、緩沖液pH9.520v

45、Tris-Cl100mmol/LvNaCl100mmol/LvMgCl250mmol/Lv11、緩沖液pH8.0(20)vTris-Cl10mmol/LvEDTA1mmol/Lv12、底物顯色液v緩沖液15ml+52.5lBCIP+67.5lNBTv-32P標(biāo)志DNA探針的原位雜交v一冰凍切片預(yù)處置v1.新穎取材組織置液氮冷凍的異戊烷中。v2.恒冷箱切片215m，置預(yù)處置的玻片上。v3.4%多聚甲醛室溫下固定1560分鐘。v4.PBS洗210分鐘，43烤片過夜。v5.0.2mol/LHCl室溫作用10分鐘，0.1%0.3%TritonX-100作用1530分鐘。v6.0.2%甘氨酸的PBS室溫作用10分鐘。v7.蛋白酶K1g/ml37孵育1530分鐘。v8.0.2%甘氨酸的PBS室溫作用10分鐘。v9.PBS-5mmol/LMgCl2洗210分鐘。v10.逐級(jí)酒精脫水，空氣枯燥或直接37烤干保管。v二預(yù)雜交v1、切片用2SSC浸泡15分鐘。再用4SSC配制V/V的50%去離子甲酰胺37孵育15分鐘。v2、每張切片加預(yù)雜交液20l，雜交溫度下如42孵育30分鐘2小時(shí)。v三雜交v吸棄預(yù)雜交液，每張切片加雜交液20l含0.5ng/l-32P標(biāo)志D