基因工程病毒疫苗

1、第一節(jié)疫苗概述第一節(jié)疫苗概述 一、疫苗的起源與發(fā)展1、起源階段Dr Edward Jener（1796）： 用一種奶牛痘感染人類，感染后不再被天花感染。Louis Pasteur （19世紀(jì)末）： 研制成功狂犬疫苗。1978 1978 年世界衛(wèi)生組織宣布，人類消滅了天花。年世界衛(wèi)生組織宣布，人類消滅了天花。Salmon & Smith Salmon & Smith 傷寒細(xì)菌滅活疫苗傷寒細(xì)菌滅活疫苗. .Chamberlai & Roux Chamberlai & Roux 霍亂、鼠疫滅活疫苗霍亂、鼠疫滅活疫苗愛德華首先采用接種牛痘預(yù)防天花愛德華首先采用接種牛痘預(yù)

2、防天花一、疫苗的起源與發(fā)展2、發(fā)展階段（1）20世紀(jì)前30年卡介苗（BCG）：結(jié)核菌減毒苗白喉/破傷風(fēng)疫苗：化學(xué)滅活疫苗流感疫苗：禽胚中研制成功（2）二次世界大戰(zhàn)后：多種減毒和滅活病毒疫苗研制成功：脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腮腺炎疫苗、麻疹疫苗、風(fēng)疹疫苗以及腦膜炎球菌、肺炎球菌、流感桿菌疫苗一、疫苗的起源與發(fā)展3、20世紀(jì)80年代（分子技術(shù)推動(dòng)的疫苗研制）重組乙肝疫苗細(xì)菌莢膜與載體蛋白偶聯(lián)疫苗細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)減毒或滅活疫苗4、我國的情況北京、上海、蘭州、成都、長春、武漢生物制品研究所實(shí)現(xiàn)計(jì)劃免疫接種二、疫苗與基因工程疫苗1、疫苗（Vaccine)（1）傳統(tǒng)的定義： 用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的

3、活的病原微生物制成的制劑，或者用理化方法將病原微微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動(dòng)免疫，使人或動(dòng)物產(chǎn)生免疫能力。二、疫苗與基因工程疫苗2、現(xiàn)代定義： 是致病原的蛋白（多肽或肽）、多糖、或核酸，以單一成份或含有有效成份復(fù)雜顆粒的形式，或通過活的減毒致病原或載體，進(jìn)入機(jī)體后能產(chǎn)生滅活、破壞或抑制病原的特異性免疫應(yīng)答。 國際上一般將細(xì)菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗二、疫苗與基因工程疫苗3、第一代疫苗通過改變培養(yǎng)條件，或在不同寄主動(dòng)物上傳代使病原微生物毒性減弱?；蛲ㄟ^物理化學(xué)的方法將其滅活來完成的。4、第二代疫苗（基因工程疫苗）利用DNA重組技術(shù)克隆并表達(dá)保護(hù)性抗原基因，利用表達(dá)的抗原產(chǎn)

4、物或重組體本身制成的疫苗。（1）獲得大量高純度的抗原（2）安全第二節(jié)病毒疫苗的種類一、傳統(tǒng)病毒疫苗1、滅活疫苗（死疫苗）：誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG和IgM（1）優(yōu)點(diǎn)： 工藝簡單 免疫原性穩(wěn)定 易于制備（2）缺點(diǎn) 保證不含有滅活不完全的顆粒； 提供的免疫力短、常有不良過敏反應(yīng)； 不能誘生局部免疫抗體IgA,野生病毒仍可以到達(dá)侵入門戶。2.減毒疫苗(弱毒疫苗）（1）定義：微生物的自然強(qiáng)毒株通過物理、化學(xué)的和生物學(xué)的方法，連續(xù)傳代，使其對(duì)原宿主喪失致病能力，或只引起亞臨床感染，但仍能保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株的疫苗。（2）優(yōu)點(diǎn)：可以誘發(fā)全面的免疫反應(yīng)（體液免疫、細(xì)胞免疫）免疫力持久（3）減毒方法

5、 體外減毒：異源宿主中連續(xù)傳代或單一宿主中反復(fù)連續(xù)傳代。 冷適應(yīng)篩選：將病毒在低溫下連續(xù)或逐步傳代，誘導(dǎo)病毒基因組多處突變或損傷，獲得毒力減弱和各種標(biāo)志特征的冷適應(yīng)株，以此制備的疫苗。3.亞單位疫苗（1）定義：提取或合成細(xì)菌、病毒外殼的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，即抗原決定簇制成的疫苗。（2）優(yōu)點(diǎn)：副作用小、不含核酸、安全性高4.衡量疫苗能否投入使用的標(biāo)準(zhǔn)安全性安全性 刪除致病基因，保留抗原性。有效性有效性 盡可能調(diào)動(dòng)肌體細(xì)胞免疫和體液免疫。5.免疫反應(yīng)過程抗原 抗原顯示細(xì)胞吞噬抗原 抗原肽MHC蛋白 抗原肽復(fù)合物 T細(xì)胞活化免疫細(xì)胞識(shí)別、活化 B細(xì)胞活化活化T細(xì)胞 殺傷性T細(xì)胞 活化B細(xì)胞 釋放淋巴因子

6、分泌抗體 殺滅抗原二、新一代病毒疫苗（遺傳重組疫苗）二、新一代病毒疫苗（遺傳重組疫苗）（一）基因工程疫苗（一）基因工程疫苗 定義：通過基因工程表達(dá)保護(hù)性抗原基因，利用表達(dá)產(chǎn)物或重組體本身制成的定義：通過基因工程表達(dá)保護(hù)性抗原基因，利用表達(dá)產(chǎn)物或重組體本身制成的疫苗。疫苗。 種類：基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工種類：基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗程疫苗1：基因工程亞單位疫苗（1 1）定義：用基因工程表達(dá)的蛋白抗原純化后制作的疫苗。（2 2）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量大純度高免疫原性好安全性高（3）制備亞單位疫苗的前提：鑒別出什么成分引起宿主免

7、疫反應(yīng)。（4）提高免疫效果的方法 不同基因組合、使表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu)； 在體外加以聚團(tuán)化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球； 加入免疫增強(qiáng)劑（佐劑）；2.基因工程載體疫苗（1）定義：將免疫原基因與載體DNA連接的重組載體轉(zhuǎn)入受體獲得增殖培養(yǎng)物供疫苗制備，或直接將活載體接種宿主，直接在體內(nèi)表達(dá)抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。（2）優(yōu)勢(shì)： 多為活載疫苗，抗原無需純化、載體本身有佐劑的作用；常用的載體有：痘病毒、腺病毒、脊灰病毒、霍亂弧菌、沙門菌、卡介苗；多價(jià)或多聯(lián)疫苗：同時(shí)表達(dá)多種抗原（3）非復(fù)制型載體重組微生物進(jìn)入機(jī)體后，只保留DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，但不產(chǎn)生感染性后代；（4）復(fù)制型載體的制作方法利用在人體中不能繁殖的動(dòng)

8、物病毒；（例桿狀病毒）通過DNA技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行改造，使不能在人體中繁殖后代，但表達(dá)源基因的能力仍保留。3.基因缺失活疫苗定義：通過基因操作將病原微生物中與致病性有關(guān)的毒力基因缺失，使之成為無毒株或弱毒株，但仍保持良好的免疫原性4.DNA疫苗（第三代免疫） Wolf （1993）將流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種亞型TK細(xì)胞。目前已經(jīng)進(jìn)行的研究： 輪狀病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、狂犬病毒、結(jié)核桿菌亞單位疫苗等。（1）二個(gè)特點(diǎn)：DNA（帶有免疫原基因）、可起免疫作用（2）優(yōu)點(diǎn)：無感染性誘發(fā)產(chǎn)生天然抗原表位的抗體誘發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)持續(xù)

9、免疫便于構(gòu)建多價(jià)疫苗穩(wěn)定性不受溫度影響純化容易有預(yù)防和免疫治療雙重功能可快速篩選具有免疫保護(hù)效果的基因能定向誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞(TH1、TH2) 為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)5.蛋白工程疫苗 定義：對(duì)抗原基因進(jìn)行改造或不同抗原基因進(jìn)行組合，以期達(dá)到增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性、擴(kuò)大反應(yīng)譜、去除有害作用或副反應(yīng)的一類疫苗（二）、遺傳重組疫苗（二）、遺傳重組疫苗利用遺傳重組的方法獲得的重組微生物制成的疫苗。（三）合成肽疫苗又稱表位疫苗：利用化學(xué)合成的方法合成能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)的多肽所制作的疫苗（四）抗獨(dú)特型抗體疫苗（1）獨(dú)特型：抗體分子與抗原結(jié)合的高變區(qū)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（2）抗獨(dú)特型抗體疫苗：使用與特定抗原免疫原性相近的抗抗

10、體（Ab2）作抗原制成的疫苗（內(nèi)影像疫苗）（五）微膠囊疫苗（可控緩釋疫苗）（1）用微膠囊技術(shù)將特定的抗原包裹后制成的疫苗。（2）微膠囊：丙交酯和乙交酯的共聚物制成，可干燥成粉狀顆粒。第三節(jié)基因工程病毒疫苗的設(shè)計(jì)與制備一、設(shè)計(jì)策略1、理想疫苗的特點(diǎn)： 有效、安全 產(chǎn)生免疫快 可大量生產(chǎn) 貯存運(yùn)輸方便 價(jià)格合理2、亞單位疫苗設(shè)計(jì)策略（1）抗原選擇 能模擬誘生有效保護(hù)性抗體應(yīng)答的抗原決定簇 具有優(yōu)勢(shì)免疫的抗原決定簇 對(duì)人體安全 特異性（2）表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)（按需要選擇）3、基因工程載體疫苗的設(shè)計(jì)策略（1 1）抗原選擇：同上（2 2）疫苗載體的選擇選擇非致病性細(xì)菌或病毒作疫苗載體。A A：理想疫苗載

11、體的條件：感染靶細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)無毒力返祖：在不斷繁殖過程中出現(xiàn)自身修復(fù)（毒力回復(fù)）無大量排毒引起的環(huán)境污染生活史中不能與宿主染色體整合操作方便接種后不會(huì)長期在體外存留B常見的疫苗載體痘苗病毒載體流感病毒載體Mengo 病毒載體金絲雀痘病毒載體仙苔病毒載體皰疹病毒載體沙門菌卡介苗病毒載體細(xì)菌載體4、基因缺失活疫苗的設(shè)計(jì) 關(guān)鍵：選擇要?jiǎng)h除的靶基因，一般為復(fù)制非必需、毒力相關(guān)的基因5、核酸疫苗的設(shè)計(jì)策略基因選擇：主要保護(hù)性抗原基因分子佐劑：增強(qiáng)核酸疫苗激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)載體：表達(dá)抗原能力強(qiáng)的載體（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polyA信號(hào)二、基因工程疫苗制備的技術(shù)路線1、基因工程亞單位疫苗

12、制備的技術(shù)路線抗原基因選擇與分離構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)化宿主（細(xì)胞）表達(dá)、純化2、基因工程載體疫苗制備技術(shù)路線抗原基因選擇與分離插入疫苗載體系統(tǒng)（細(xì)菌或病毒）重組載體體外培養(yǎng)收獲培養(yǎng)物及后處理3、基因缺失活疫苗制備技術(shù)路線選擇靶基因定向缺失靶基因基因缺失毒株的培養(yǎng)收獲病毒及后處理4、核酸疫苗制備技術(shù)路線目的抗原基因的選擇與分離構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增純化重組質(zhì)粒后處理三、基因工程病毒疫苗的質(zhì)量控制（1）注意：抗原基因、表達(dá)載體的變異和穩(wěn)定性 安全要求：重組后的基因產(chǎn)物無致病性、無毒性、無潛在危險(xiǎn) 有效性要求：保證表達(dá)后的蛋白具有良好的抗原性和免疫原性 穩(wěn)定性和重復(fù)性要求：同樣的方法可以重復(fù)生產(chǎn)和制

13、造（2）研制階段的要求：插入基因：所有的背景清楚、克隆過程清楚載體：背景（啟動(dòng)子、復(fù)制子、抗藥性等）清楚宿主細(xì)胞：背景（來源、表型、遺傳型及相應(yīng)的標(biāo)記基因）清楚第四節(jié)基因工程病毒疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀一、需研制的基因工程病毒疫苗艾滋病乙型肝炎丙型肝炎戊型肝炎EBV肝炎人乳頭瘤病毒（宮頸癌）單純皰疹病毒巨細(xì)胞病毒呼吸道合胞病毒輪狀病毒登革熱病毒埃博拉病毒二、重要病毒性疾病基因工程疫苗的研究進(jìn)展1、艾滋病疫苗（AIDS）艾滋病全稱“獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome )”，簡稱AIDS。1981年，首例艾滋病病例在美國同性戀人群中發(fā)現(xiàn)?！叭祟惷庖呷毕?/p>

14、病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)”并確定艾滋病是由這種逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)所引起。 The transmission route of HIV-1 in ChinaSHANXIFUJIANXIZHANGHEILONGJIANGJILINLIAONINGNEIMENGGUBeijingTian JinQINGHAIHEBEININGXIAGANSUSHAN XIANHUIHENANSHANDONGShang HaiJIANGXIHUBEIJIANGSUHUNANGUANGDONGGUANGXIGUIZHOUHAINANYUNNANSICH

15、UANTAIWANXINJIANGChong QingZHEJIANGCRF07-BCBCRF01-AEB傳入我國C傳入我國CRF08-BCRisk Factors for Cumulative HIV/AIDS cases in China(1985-2004)Blood/productsMTCTBlood collectionHetero/Homo sex采血29.6%29.6%血液/ /血制品3.1%3.1%異性/ /同性8.2%8.2%靜注毒品42.0%42.0%母嬰傳播1.0%1.0%IDUsOthers不詳16.1%16.1% HIV病毒在RNA基因組通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA時(shí),

16、容易發(fā)生誤差。 在與體內(nèi)免疫系統(tǒng)相互作用的過程中, HIV不斷演化,結(jié)果產(chǎn)生病毒變異。變異的速度非?？?據(jù)測(cè)定, HIV感染者體內(nèi)每天至少產(chǎn)生108變異病毒,同一個(gè)體內(nèi)不同病毒之間的差異可達(dá)10%15%。（1）HIV的生物學(xué)A、病毒蛋白直徑約100nm的球狀病毒,粒子外包被著由兩層脂質(zhì)構(gòu)成的脂膜, (主要是gp41和gp120)的脂質(zhì)源于寄主細(xì)胞的質(zhì)膜。gp41：病毒衣殼的穿膜蛋白；gp120：病毒的主要衣殼糖蛋白，它與HIV 成功感染有關(guān)。P17：膜內(nèi)側(cè)面緊貼著蛋白質(zhì)，核心部分是截去頭部的圓錐體，由蛋白質(zhì)P24所構(gòu)成的衣殼包裹。蛋白質(zhì)P24和P18組成其核心。反轉(zhuǎn)錄酶。其功能是催化病毒RNA

17、的反轉(zhuǎn)錄。B、病毒基因 Gag：編碼衣殼蛋白(Gag) Pol：病毒復(fù)制所必須的酶(Pol) Env：外膜糖蛋白(Env)。 Tat：反式作用轉(zhuǎn)錄編碼區(qū) rev ：即抗阻遏物翻譯區(qū) Nef：長開放閱讀框 Vif：短開放閱讀框 兩個(gè)長末端重復(fù)序列 (LTR)C、HIV的復(fù)制與侵染細(xì)胞的過程 （2）HIV疫苗研制 由于HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒，故有人擔(dān)心其核酸有可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，完整病毒疫苗不宜采用。所以研制AIDS疫苗的主要探索應(yīng)包括：從病毒包膜中純化糖蛋白抗原；合成特異性抗原；分離編碼這些抗原的病毒基因組；利用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目乖Ｒ呙珙愋鸵呙珙愋吞攸c(diǎn)特點(diǎn)效果效果預(yù)防性疫苗預(yù)防性疫苗預(yù)防感染

18、預(yù)防感染免疫個(gè)體不被野病毒感染免疫個(gè)體不被野病毒感染一級(jí)預(yù)防一級(jí)預(yù)防阻止發(fā)病阻止發(fā)病免疫個(gè)體被野病毒感染后維持免疫個(gè)體被野病毒感染后維持在亞臨床狀態(tài)在亞臨床狀態(tài)二級(jí)預(yù)防二級(jí)預(yù)防減少傳播減少傳播免疫個(gè)體被野病毒感染后血液免疫個(gè)體被野病毒感染后血液中病毒載量明顯低于未免疫個(gè)中病毒載量明顯低于未免疫個(gè)體，不易將病毒傳給他人體，不易將病毒傳給他人三級(jí)預(yù)防三級(jí)預(yù)防治療性疫苗治療性疫苗 免疫后使感染者返回或維持在免疫后使感染者返回或維持在亞臨床感染狀態(tài)亞臨床感染狀態(tài)多與藥物多與藥物合并使用合并使用傳統(tǒng)疫苗形式減毒活疫苗滅活疫苗病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNARNA反轉(zhuǎn)錄DNA基因插入質(zhì)粒PCR抗原基因克隆表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒擴(kuò)增與純化質(zhì)粒在菌內(nèi)擴(kuò)增質(zhì)粒純化提取轉(zhuǎn)化第二節(jié)病毒疫苗的種類一、傳統(tǒng)病