免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理

1、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 的基本原理的基本原理 免疫學(xué)診斷免疫學(xué)診斷抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)淋巴細(xì)胞的測(cè)定淋巴細(xì)胞的測(cè)定免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用 目的要求目的要求1.1.掌握：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、免疫掌握：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、免疫 標(biāo)記技術(shù)的概念；凝集反應(yīng)、沉淀標(biāo)記技術(shù)的概念；凝集反應(yīng)、沉淀 反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)的常用方法及反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)的常用方法及 實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用. . 2.2.熟悉：細(xì)胞免疫檢測(cè)法的基本原理熟悉：細(xì)胞免疫檢測(cè)法的基本原理 及實(shí)際應(yīng)用及實(shí)際應(yīng)用; ;3.3.了解：其他免疫學(xué)檢測(cè)方法及其應(yīng)用了解：其他免疫學(xué)檢測(cè)方法及其應(yīng)用 ( (一一) )抗原抗

2、體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 1. 1.抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的特異性特異性 2. 2.抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的可逆性可逆性 4. 4.抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的階段性：階段性： 特異性結(jié)合階段、肉眼可見階段特異性結(jié)合階段、肉眼可見階段 3.3.抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的可見性可見性一、抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素一、抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素 Ab 過剩Ag 過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性反應(yīng)的可見性（二）抗原抗體反應(yīng)的影響因素（二）抗原抗體反應(yīng)的影響因素 電解質(zhì)電解質(zhì) 抗原抗體抗原抗體（等電點(diǎn)（等電點(diǎn)pH3-5pH3-5和和pH5-6pH5-6）在中

3、性或弱堿性條件下帶有負(fù)電荷，在中性或弱堿性條件下帶有負(fù)電荷，需需適當(dāng)濃度的電解質(zhì)適當(dāng)濃度的電解質(zhì)（如（如0.85%NaCl0.85%NaCl）才才會(huì)結(jié)合；會(huì)結(jié)合； 溫度溫度 通常為通常為37371.1.酸堿度酸堿度 最適最適pHpH值在值在6-86-8之間之間。pHpH值值接近等電點(diǎn)時(shí)，抗原抗體多帶正負(fù)電接近等電點(diǎn)時(shí)，抗原抗體多帶正負(fù)電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。二、抗原或抗體的體外檢測(cè)方法二、抗原或抗體的體外檢測(cè)方法1.1.凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 細(xì)菌、紅細(xì)胞等細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒

4、性抗原顆粒性抗原與相應(yīng)與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊凝集團(tuán)塊稱凝集反應(yīng)。稱凝集反應(yīng)。直接凝集反應(yīng)的作法及應(yīng)用直接凝集反應(yīng)的作法及應(yīng)用玻片法：定性試驗(yàn)玻片法：定性試驗(yàn),主要用于細(xì)主要用于細(xì)菌與人類菌與人類ABO血型的鑒定。血型的鑒定。試管法：半定量試驗(yàn)試管法：半定量試驗(yàn).常用于檢測(cè)抗常用于檢測(cè)抗體的滴度或效價(jià)，臨床診斷傷寒或體的滴度或效價(jià)，臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)氏菌病所用的瑞特試驗(yàn) 1:2稀釋待測(cè)血清稀釋待測(cè)血清 1:4 1:8 1:16 玻片法玻片法試管法試管法直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng) 間接凝集反應(yīng)的應(yīng)用間接凝

5、集反應(yīng)的應(yīng)用常用的載體顆粒：人常用的載體顆粒：人O型血紅細(xì)胞型血紅細(xì)胞和和 聚苯乙烯乳膠顆粒聚苯乙烯乳膠顆粒應(yīng)用：鏈球菌應(yīng)用：鏈球菌O抗體的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)抗體的檢測(cè)實(shí)驗(yàn); 類風(fēng)濕因子的檢測(cè)類風(fēng)濕因子的檢測(cè).Coombs試驗(yàn)試驗(yàn)2.沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物沉淀物稱沉淀反應(yīng)。稱沉淀反應(yīng)。單向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散免疫比濁法免疫比濁法雙向免疫擴(kuò)散雙向免疫擴(kuò)散免疫電泳免疫電泳 抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)單向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用單向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用應(yīng)用：測(cè)定血清中應(yīng)用：測(cè)定血清中IgG、IgM、IgA 與補(bǔ)體與補(bǔ)體C3的含量的含量.缺點(diǎn)缺點(diǎn):12天才出結(jié)

6、果。天才出結(jié)果。雙向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用雙向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用應(yīng)用：根據(jù)沉淀線的數(shù)目和形狀可應(yīng)用：根據(jù)沉淀線的數(shù)目和形狀可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性檢測(cè)、組分對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性檢測(cè)、組分分析等。分析等。對(duì)流免疫電泳可檢測(cè)：對(duì)流免疫電泳可檢測(cè)： 血液中的血液中的HBsAg和和AFP 免疫比濁法主要用于：免疫比濁法主要用于： 血清蛋白及抗體成分的分析研究血清蛋白及抗體成分的分析研究3.免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù) 抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè) 用用熒光素?zé)晒馑?、酶酶、同位素同位素等?biāo)記抗等標(biāo)記抗體或抗原用以測(cè)定相應(yīng)抗原或抗體的體或抗原用以測(cè)定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。特點(diǎn)：敏感

7、、特異、快速，能定性、特點(diǎn)：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。定量、定位。免疫印跡法免疫印跡法免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 放射免疫測(cè)定法放射免疫測(cè)定法免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) 免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)常用方法常用方法酶免疫測(cè)定法酶免疫測(cè)定法ELISA(1)(1)酶免疫測(cè)定法（酶免疫測(cè)定法（ELISAELISA） ： 19711971年瑞典學(xué)者年瑞典學(xué)者EngvailEngvail和和Perlman-Perlman-nn,nn,荷蘭學(xué)者荷蘭學(xué)者Van WeermanVan Weerman和和SchuursSchuurs分別分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微

8、量報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。疫吸附試驗(yàn)。 抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)l間接法間接法: : 常用于常用于檢測(cè)血清中的抗體檢測(cè)血清中的抗體。將已知抗。將已知抗原包被于固相載體，加入待檢標(biāo)本，若標(biāo)原包被于固相載體，加入待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中有相應(yīng)的抗體，則可與抗原結(jié)合，再本中有相應(yīng)的抗體，則可與抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗，洗滌后加底物，底物受酶加入酶標(biāo)二抗，洗滌后加底物，底物受酶的催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。的催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。 此法是測(cè)定抗體最常用的方法。 間接法間接法已知抗原待測(cè)抗體酶標(biāo)抗體 抗

9、原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)l雙抗體夾心法雙抗體夾心法: : 常用于常用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗原。將已。將已知抗體包被在固相載體上，加入待測(cè)知抗體包被在固相載體上，加入待測(cè)標(biāo)本，使其中的抗原與抗體結(jié)合，洗標(biāo)本，使其中的抗原與抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗原，加入已知的酶標(biāo)抗去未結(jié)合的抗原，加入已知的酶標(biāo)抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再洗去未結(jié)合體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加入底物，底物受酶的的酶標(biāo)抗體，加入底物，底物受酶的催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。 雙抗體夾心法雙抗體夾心法抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體底物lBAS-ELISA:BAS-ELISA:可用來檢

10、測(cè)細(xì)菌、病毒、腫可用來檢測(cè)細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞表面抗原等瘤細(xì)胞表面抗原等。 生物素與抗生物素與抗生物素生物素有極高的親和力，利用有極高的親和力，利用抗生物素抗生物素為橋梁為橋梁，聯(lián)結(jié)生物素化的抗體及生物素化過氧，聯(lián)結(jié)生物素化的抗體及生物素化過氧化物酶，可獲得化物酶，可獲得極高極高的敏感性（多級(jí)放的敏感性（多級(jí)放大系統(tǒng)）。大系統(tǒng)）。 -Ab+-Ab+待測(cè)待測(cè)Ag+ Ag+ Ab-Ab-生物素化生物素化+ +抗生物素（四價(jià)）抗生物素（四價(jià)）+ + 生物素化生物素化EE+ +底物底物卵白及某些微生物中的蛋白質(zhì)卵白及某些微生物中的蛋白質(zhì) 抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)l微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)微粒捕獲

11、酶免疫分析技術(shù) 常用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物常用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物(CEA(CEA、AFP)AFP)性激素、甲狀腺素（性激素、甲狀腺素（T3T3、T4T4）、）、HCGHCG等等微微量可溶性抗原量可溶性抗原 。將已知抗體致敏的微粒。將已知抗體致敏的微粒與生物素與生物素親和素酶親和素酶放大系統(tǒng)結(jié)合，最后放大系統(tǒng)結(jié)合，最后酶酶作用于作用于熒光底物熒光底物，通過檢測(cè)，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度來判斷未知抗原的含量。來判斷未知抗原的含量。 u磁性微粒子固相：直徑磁性微粒子固相：直徑2.82.8微米，粒子小，懸微米，粒子小，懸 液類似液相；包被面積大；磁吸引分離方便。液類似液相；包被面積大；磁吸引分離方便。 抗原或

12、抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè)l免疫組化技術(shù)：指帶顯色劑（酶）標(biāo)免疫組化技術(shù)：指帶顯色劑（酶）標(biāo)記的特異性抗體或抗原在組織細(xì)胞原位記的特異性抗體或抗原在組織細(xì)胞原位發(fā)生抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反發(fā)生抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性對(duì)相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)的技術(shù)、定量檢測(cè)的技術(shù)。 免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)(2)(2)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 是用熒光素標(biāo)記一抗或二抗，檢是用熒光素標(biāo)記一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法。測(cè)特異性抗原或抗體的方法。常用的常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白熒光素有異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白等等. .l直接熒光法

13、：直接熒光法：檢測(cè)不同的抗原檢測(cè)不同的抗原，需要不，需要不同的特異性熒光抗體同的特異性熒光抗體l間接熒光法：用一抗與樣本中的抗原結(jié)間接熒光法：用一抗與樣本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。此方合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。此方法法既可檢測(cè)抗原又可檢測(cè)抗體既可檢測(cè)抗原又可檢測(cè)抗體。若查抗。若查抗原，一抗為已知的；若查抗體，抗原是原，一抗為已知的；若查抗體，抗原是已知的。一種熒光抗體可用于多種不同已知的。一種熒光抗體可用于多種不同抗原的檢測(cè)抗原的檢測(cè)(3)(3)放射免疫測(cè)定法放射免疫測(cè)定法(RIA(RIA）：是用放射性）：是用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免

14、疫測(cè)定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)高等優(yōu)點(diǎn). . 用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)，用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)，敏感性可達(dá)到敏感性可達(dá)到pg/mlpg/ml水平。常用的放射水平。常用的放射性核素有性核素有131131I I和和125125I I等。等。(3)(3)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)（化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)（CLIACLIA）：）： 將化學(xué)發(fā)光（如魯米諾）分析和將化學(xué)發(fā)光（如魯米諾）分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。疫分析技術(shù)。 特點(diǎn)：靈

15、敏度高、特異性強(qiáng)特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng) 分離簡(jiǎn)便、自動(dòng)化分析。分離簡(jiǎn)便、自動(dòng)化分析。（4 4）免疫膠體金技術(shù)（）免疫膠體金技術(shù)（ICSICS）：）： 用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，以檢測(cè)未知抗原或抗體的方法稱免以檢測(cè)未知抗原或抗體的方法稱免疫膠體金技術(shù)。疫膠體金技術(shù)。 （5 5）免疫印跡技術(shù)）免疫印跡技術(shù) 又稱又稱Western blottingWestern blotting，是將十二，是將十二烷基磺酸鈉（烷基磺酸鈉（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）分離得到的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載）分離得到的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體膜上，再用標(biāo)記的特異

16、性抗血清或單體膜上，再用標(biāo)記的特異性抗血清或單克隆抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析克隆抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析的技術(shù)。敏感性為的技術(shù)。敏感性為1 15ng5ng。4 4、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 常用于微生物感染的檢測(cè)。其原理常用于微生物感染的檢測(cè)。其原理是將是將各種蛋白質(zhì)固定于載體上制成芯片各種蛋白質(zhì)固定于載體上制成芯片，再用熒光標(biāo)記抗體與芯片作用，洗去，再用熒光標(biāo)記抗體與芯片作用，洗去未結(jié)合的抗體后，用熒光掃描儀或激光未結(jié)合的抗體后，用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)測(cè)定芯片上各點(diǎn)熒光強(qiáng)共聚焦掃描技術(shù)測(cè)定芯片上各點(diǎn)熒光強(qiáng)度，以此度，以此檢測(cè)檢測(cè)熒光對(duì)應(yīng)的熒光對(duì)應(yīng)的抗體抗體及其相互及

17、其相互結(jié)合的程度。結(jié)合的程度。三、免疫細(xì)胞的測(cè)定三、免疫細(xì)胞的測(cè)定人的免疫細(xì)胞測(cè)定：外周血人的免疫細(xì)胞測(cè)定：外周血?jiǎng)游锏拿庖呒?xì)胞測(cè)定：動(dòng)物的免疫細(xì)胞測(cè)定： 外周血、胸腺、脾臟與其他組織。外周血、胸腺、脾臟與其他組織。常用的方法：葡萄糖常用的方法：葡萄糖- -泛影葡胺密泛影葡胺密 度梯度離心法。度梯度離心法。 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞及其亞群的分離1.1.免疫吸附分離法免疫吸附分離法: :獲得不同的獲得不同的T T細(xì)胞亞群細(xì)胞亞群2.2.免疫磁珠分離法：獲得不同表面標(biāo)志的免疫磁珠分離法：獲得不同表面標(biāo)志的 活活T T細(xì)胞亞群細(xì)胞亞群. . 3.

18、3.免疫磁珠法免疫磁珠法4.4.抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子四聚體技術(shù)分子四聚體技術(shù) l免疫吸附分離法：免疫吸附分離法： 將已知抗淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的抗將已知抗淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體包被聚苯乙烯培養(yǎng)板，加入淋巴細(xì)體包被聚苯乙烯培養(yǎng)板，加入淋巴細(xì)胞懸液，表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志的淋胞懸液，表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞可被吸附在培養(yǎng)板上，即可與巴細(xì)胞可被吸附在培養(yǎng)板上，即可與其他細(xì)胞分開。其他細(xì)胞分開。 免疫吸附分離法免疫吸附分離法加入淋巴加入淋巴細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清棄上清l免疫磁珠法免疫磁珠法: :應(yīng)用較廣泛應(yīng)用較廣泛 是一種特異性分離所需淋巴細(xì)

19、胞的是一種特異性分離所需淋巴細(xì)胞的方法。首先將特異性抗體（如抗方法。首先將特異性抗體（如抗CD3CD3、抗、抗CD4CD4或抗或抗CD8CD8等）吸附在磁性微珠上，與等）吸附在磁性微珠上，與待測(cè)細(xì)胞懸液中的相應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合待測(cè)細(xì)胞懸液中的相應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合后后, ,再將磁珠結(jié)合細(xì)胞與未結(jié)合磁珠細(xì)胞再將磁珠結(jié)合細(xì)胞與未結(jié)合磁珠細(xì)胞分開，即可獲得純度高的所需細(xì)胞。分開，即可獲得純度高的所需細(xì)胞。 磁珠分離法磁珠分離法l熒光激活細(xì)胞分選儀分離法：熒光激活細(xì)胞分選儀分離法： （流式細(xì)胞術(shù)分離法）（流式細(xì)胞術(shù)分離法） 是一種集光學(xué)、流體力學(xué)、電力學(xué)和是一種集光學(xué)、流體力學(xué)、電力學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體，可

20、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測(cè)定和綜合分析方法定量測(cè)定和綜合分析方法. . 定量分析活細(xì)胞表面表達(dá)的特異分子定量分析活細(xì)胞表面表達(dá)的特異分子 免疫細(xì)胞分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)。免疫細(xì)胞分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)。 白血病和淋巴瘤的免疫學(xué)分型。白血病和淋巴瘤的免疫學(xué)分型。 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)熒光抗體標(biāo)記混合細(xì)胞記混合細(xì)胞噴嘴噴嘴單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液5000-10000個(gè)個(gè)/秒秒細(xì)胞分選器細(xì)胞分選器熒光熒光檢測(cè)器檢測(cè)器l抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子四聚體技術(shù)分子四聚體技術(shù) 將特異性抗原肽段、可溶性將特異性抗原肽段、可溶性MHC-

21、MHC-類分子重鏈及類分子重鏈及22微球蛋白在體外正確折微球蛋白在體外正確折疊，在親和素存在下構(gòu)建四聚體，并結(jié)疊，在親和素存在下構(gòu)建四聚體，并結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)外周血及組織中合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)外周血及組織中抗原特異性抗原特異性CTLCTL的比率。的比率。 淋巴細(xì)胞及其淋巴細(xì)胞及其亞群的分離亞群的分離免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞功能測(cè)定功能測(cè)定磁珠分磁珠分離法離法免疫吸附免疫吸附分離法分離法流式細(xì)流式細(xì)胞術(shù)胞術(shù)肽肽MHC四聚四聚體技術(shù)體技術(shù)T細(xì)胞功細(xì)胞功能測(cè)定能測(cè)定B細(xì)胞功細(xì)胞功能測(cè)定能測(cè)定細(xì)胞因細(xì)胞因子檢測(cè)子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒細(xì)胞毒試

22、驗(yàn)試驗(yàn)吞噬功吞噬功能測(cè)定能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法（三）淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定（三）淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定1.T淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定 形態(tài)學(xué)方法：形態(tài)學(xué)方法：T淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn). 3H-TdR摻入法摻入法:靈敏性高靈敏性高,但有放射污染但有放射污染. MTT法：靈敏性不及法：靈敏性不及3H-TdR摻入法摻入法,但但 無放射污染無放射污染.（4）遲發(fā)型超敏反應(yīng)（）遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）的檢測(cè)）的檢測(cè) l形態(tài)學(xué)方法：形態(tài)學(xué)方法：T T淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) T T淋巴細(xì)胞在體外培

23、養(yǎng)時(shí)，在有絲淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，在有絲分裂原刺激下分裂原刺激下, ,可轉(zhuǎn)化為可轉(zhuǎn)化為T T淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞( (體積增大、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增體積增大、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁) )。通。通過觀察培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，了解其細(xì)胞的過觀察培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，了解其細(xì)胞的增殖變化。增殖變化。l3H-TdR摻入法摻入法: T細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞增殖過程中DNA和和RNA合成合成會(huì)增加。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氚標(biāo)記的會(huì)增加。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）或）或125I標(biāo)記的尿標(biāo)記的尿嘧啶核苷（嘧啶核苷（125-UdR），

24、則會(huì)被摻入細(xì)），則會(huì)被摻入細(xì)胞核中。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用液體胞核中。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用液體閃爍儀測(cè)定樣本中放射性活性，可反映閃爍儀測(cè)定樣本中放射性活性，可反映細(xì)胞的增殖水平。細(xì)胞的增殖水平。 靈敏性高靈敏性高, 有放射污染。有放射污染。放射性測(cè)定3H-TdR絲裂原刺激淋淋巴巴細(xì)細(xì)胞胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化試試驗(yàn)驗(yàn)原原理理示示意意 MTT法：靈敏性不及法：靈敏性不及3H-TdR摻入法摻入法 但無放射污染但無放射污染. T細(xì)胞增殖時(shí)，線粒體中的琥珀酸脫細(xì)胞增殖時(shí)，線粒體中的琥珀酸脫氫酶將氫酶將MTT還原為還原為紫褐色的甲臜顆粒，紫褐色的甲臜顆粒，該顆粒被隨后加入的異丙醇或二甲基亞砜該顆粒被隨后加入的異丙醇

25、或二甲基亞砜溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中溶溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中溶解紫褐色甲臜的解紫褐色甲臜的OD值，即反映細(xì)胞的增值，即反映細(xì)胞的增殖水平。殖水平。 （ MTT一種噻唑鹽，二苯基溴一種噻唑鹽，二苯基溴化四唑，淡黃色可溶性物質(zhì)）?；倪?，淡黃色可溶性物質(zhì)）。l遲發(fā)型超敏反應(yīng)（遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH） 體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞免疫功能的皮試方法體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞免疫功能的皮試方法原理：被抗原已致敏的機(jī)體，再用相同原理：被抗原已致敏的機(jī)體，再用相同的抗原作皮試可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，的抗原作皮試可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)， 72小時(shí)后局部充血、滲出、紅腫和硬結(jié)小時(shí)后局部充血、滲出、紅腫和硬結(jié)。細(xì)胞免疫正常

26、者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者則呈弱陽性或陰性反應(yīng)。免疫低下者則呈弱陽性或陰性反應(yīng)。 常用于檢測(cè)某些微生物感染常用于檢測(cè)某些微生物感染 2.B2.B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) (1)(1)利用前面介紹的抗原抗體檢測(cè)方法利用前面介紹的抗原抗體檢測(cè)方法 測(cè)定標(biāo)本中抗體含量。測(cè)定標(biāo)本中抗體含量。 (2)(2)抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)：抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)： 又稱溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn)又稱溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn), ,可可 檢測(cè)產(chǎn)生抗體的檢測(cè)產(chǎn)生抗體的B B細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞數(shù)量。 3.細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn):是檢測(cè)是檢測(cè)CTL、NK等細(xì)胞等細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞活性的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。殺傷

27、靶細(xì)胞活性的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。主要用主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)和病毒感染于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)和病毒感染等方面的研究。等方面的研究。 4.吞噬細(xì)胞功能測(cè)定吞噬細(xì)胞功能測(cè)定 顯微鏡測(cè)定法顯微鏡測(cè)定法 吞噬率（）吞噬率（）= =（吞噬細(xì)菌的（吞噬細(xì)菌的吞噬吞噬細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù) 200200個(gè)個(gè)吞噬吞噬細(xì)胞）細(xì)胞）100 100 吞噬指數(shù)吞噬指數(shù)= =（200200個(gè)個(gè)吞噬吞噬細(xì)胞中所吞噬的細(xì)菌細(xì)胞中所吞噬的細(xì)菌 總數(shù)總數(shù) 200 200個(gè)吞噬細(xì)菌的個(gè)吞噬細(xì)菌的吞噬吞噬細(xì)胞）細(xì)胞） 100 100 5 5細(xì)胞因子的測(cè)定細(xì)胞因子的測(cè)定 細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于了解其在細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作

28、用，監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫功免疫調(diào)節(jié)中的作用，監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫功能。常檢測(cè)的細(xì)胞因子有能。常檢測(cè)的細(xì)胞因子有IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-10IL-10、IFN-IFN-等。等。常用的方法主要常用的方法主要有生物活性檢測(cè)法、有生物活性檢測(cè)法、ELISAELISA法等。法等。三、免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用三、免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用（一）協(xié)助診斷感染性疾?。ㄒ唬﹨f(xié)助診斷感染性疾?。ㄈ﹨f(xié)助診斷免疫系統(tǒng)疾?。ㄈ﹨f(xié)助診斷免疫系統(tǒng)疾病（四）進(jìn)行免疫學(xué)監(jiān)測(cè)（四）進(jìn)行免疫學(xué)監(jiān)測(cè)（二）協(xié)助診斷腫瘤（二）協(xié)助診斷腫瘤思考題思考題1.1.解釋名詞解釋名詞 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)2.2.可用哪

29、些方法定量檢測(cè)血液標(biāo)本中的抗原？可用哪些方法定量檢測(cè)血液標(biāo)本中的抗原？3.3.可用哪些方法檢測(cè)組織中的抗原？可用哪些方法檢測(cè)組織中的抗原？4.HIV4.HIV、HBVHBV感染者的診斷和病情監(jiān)測(cè)可用哪感染者的診斷和病情監(jiān)測(cè)可用哪些方法些方法? ?凝集反應(yīng)原理圖解（一）凝集反應(yīng)原理圖解（一）凝集反應(yīng)原理圖解（二）凝集反應(yīng)原理圖解（二）凝集反應(yīng)原理圖解（三）凝集反應(yīng)原理圖解（三） 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳(immunoelectrophoresis) 對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳 火箭電泳火箭電泳測(cè)吸光度測(cè)吸光度抗體抗體抗原抗原免疫復(fù)合物的免疫復(fù)合物的

30、濃度與透射光濃度與透射光的衰減呈正相的衰減呈正相關(guān)。關(guān)。免疫比濁法原理免疫比濁法原理 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA-間接法間接法)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)?zāi)z體金：氯金酸（膠體金：氯金酸（HAuCl4HAuCl4）在還原劑的）在還原劑的作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，因其在靜電作用下而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)因其在靜電作用下而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。，故稱膠體金。斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn) 用膠體金作為標(biāo)記物來檢測(cè)抗原或用膠體金作為標(biāo)記物來檢測(cè)抗原或抗體的方法。膠體金顆粒聚集后呈紅色抗體的方法。膠體

31、金顆粒聚集后呈紅色，可用于標(biāo)記多種大分子，如白蛋白、，可用于標(biāo)記多種大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。植物血凝素、卵白素等。 兔抗鼠兔抗鼠IgG鼠抗鼠抗HCG單抗單抗金標(biāo)鼠抗金標(biāo)鼠抗HCG單抗單抗尿液浸濕標(biāo)志線尿液浸濕標(biāo)志線 手持端手持端斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（一）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（一）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）尿樣尿樣陽性陽性弱陽性弱陽性陰性陰性免疫印跡法圖解免疫印跡法圖解裂解病毒裂解病毒聚丙酰胺凝膠電泳聚丙酰胺凝膠電泳-+ 95 68 45 12KD電轉(zhuǎn)印至電轉(zhuǎn)印至NC膜上膜上置待測(cè)血清中，漂洗；

32、置待測(cè)血清中，漂洗；加酶標(biāo)抗抗體，漂洗；加酶標(biāo)抗抗體，漂洗；加底物加底物 顯色顯色120 41 24KD十二烷基磺酸鈉SDS T T細(xì)胞亞群的檢測(cè)細(xì)胞亞群的檢測(cè)抗抗凝凝血血 分層液分層液 抗凝血抗凝血血漿血漿 白膜層白膜層 紅細(xì)胞紅細(xì)胞離心離心淋巴細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的分離 T細(xì)胞亞群的檢測(cè)細(xì)胞亞群的檢測(cè)花環(huán)法（一）花環(huán)法（一） T細(xì)胞亞群的檢測(cè)細(xì)胞亞群的檢測(cè)花環(huán)法（二）花環(huán)法（二）PHA淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意圖淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意圖細(xì)胞細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）淋轉(zhuǎn)（標(biāo)本片）操作流程操作流程1.制備抗體包被板（試劑盒中所帶） 2.加待測(cè)標(biāo)本及對(duì)照品；加酶標(biāo)記物 3.溫育，37 30min 4.漂洗（磷酸緩沖鹽水） ,20s*5次 5.加底物(四甲基聯(lián)苯胺)、顯色劑(H(H2 2O O2 2) )37 5min 6.結(jié)果測(cè)定E