Western-Blotting實驗報告

1、文檔來源為：從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word版本可編輯.歡迎下載支持Western Blotting本次試驗的目的是使同學(xué)們掌握 Western Blotting法鑒定目標蛋白的原理和 熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的影響因素。Western Blotting 的blotting 譯為印跡法，是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA RNA雜交檢測 特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對 RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分

2、析，對 RNA的印跡分析稱為Northern 印跡法，對 單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Western印跡法，對雙向電泳后蛋白 質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。Western既可以定性，又可以半定量，是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。它通常分為兩種方法：Western Blotting方：直接法方法二：間接法優(yōu)點：1 .快速（一種抗體）2 .沒有一抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶1 .免特異性不受標記影響2 .信號放大靈敏度高（多個二抗結(jié)合位點）3 .多種標記的二抗可供選擇4 .可選擇/、同的 Marker缺點：1.免疫反應(yīng)性降低1.交叉反應(yīng)引起的非特2.無信號二級放大異性

3、條帶3.抗體標記費時昂貴，使2.額外的二抗孵育以及用/、方便條件優(yōu)化同時Western又具有多種識別蛋白質(zhì)的顯色方法，主要有以下幾種：i.放 射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL iii.底物熒光ECF iv.底物DAB呈色現(xiàn)常 用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。一、實驗原理Western Blotting（蛋白質(zhì)免疫印跡法）是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳奮力的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價 鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相 載體上的蛋白質(zhì)為抗原，與之對應(yīng)的第一抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，一抗再與酶或 同位素標記的第二抗體發(fā)生

4、免疫結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色活放射自顯影以檢查電泳分離的提議目的蛋白成分。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免 疫測定特異性高、敏感等諸多優(yōu)點，能從復(fù)雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定 量檢測。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acr）、N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）和催 化劑（AP）、加速劑（TEMED聚合成的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)（凝膠）。據(jù)有無濃縮效應(yīng)可將 電泳分為兩類：i .連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液pH值、凝膠濃度相同，帶電粒子靠電荷及分子篩效 應(yīng)區(qū)分。ii .不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度不同，帶電粒子在電場中由電效應(yīng)、 分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)區(qū)分。2文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.wor

5、d 版本可編輯.歡迎下載支持SDS-PAGE 的原理是：依靠 SDS 帶有大量負電荷來掩蓋蛋白質(zhì)表面的凈電荷：同時由于在電泳溶液中加入了 SDS 和巰基乙醇，因此它還可以改變蛋白質(zhì)構(gòu)象：在實驗中要注意： 印跡法需要較好的蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)， 是蛋白質(zhì)樣品達到良好的分離效果，而且要注意膠的質(zhì)量，是蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)移帶固相支持物上，另外蛋白質(zhì)在電泳過程中分離得到的條帶被保留在膜上， 在隨后的寶物階段不丟失和擴散。免疫印跡分析之需要很小體積的時間，較短的時間過長，操作容易，適用于理論和應(yīng)用上的研究。本實驗采用人血清為材料，人類Ig 根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類： IgG 、 I

6、gA 、 IgM 、 IgD 、 IgE 。其中 IgG 占血清免疫球蛋白總量的75%80%。人的IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們之間以二硫鍵相連。在加 SDS 的電泳條件下，分子中的二硫鍵被還原成游離的巰基，四條鏈分開，重鏈遷移速度較慢，輕鏈遷移速度較快，可跑出兩條帶。對此樣品進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE )后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上， 用兔抗人 IgG 為第一抗體， 用辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG為第二抗體，在過氧化物酶第五存在的情況下，檢測人的 IgG 。二、 試劑，器材和實驗材料【試劑】1. 30 丙烯酰胺貯備液： 29.2g 丙烯酰胺，

7、 0.8g 甲叉雙丙烯酰胺，加重蒸水至 100ml 。2. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl ， pH6.8 。3. 分離膠緩沖液：3mol/L Tris-HCl ， pH8.9 。4. 10 過硫酸銨(w/v) ：臨用前用蒸餾水配制。5. 10 SDS(w/v) 。6. 10 TEMED 。7. 電極緩沖液： 甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至 800ml ， pH8.3 。8. 樣品緩沖液： 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液， pH6.8 ， 20 甘油，4SDS， 10 巰基乙醇， 0.005 溴酚蘭。9. 考馬斯亮藍R25

8、0 染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g ， 30% 乙醇， 10%冰乙酸。10. 脫色液：乙醇6ml ，冰乙酸 2ml ，加水至 20ml 。11. TBS( Tris-HCl,NaCl )緩沖液： 20mmol/L Tris-HCl,12. 500mmol/L NaCl ， pH7.5 ，每組配 150ml 。13. TTBS:取 100mlTBS ,力口 250 川 20 % Tween-20 。14. 封閉液及抗體稀釋液：3脫脂奶粉-TBS ，每組配 10ml 。15. 底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺(DAB) + 10mlTBS +10 pl H2O2 ,臨用 前配制。16. 考

9、馬斯亮藍R250 染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g ， 30% 乙醇， 10%冰乙酸，總體積500ml 。17. 脫色液：乙醇6ml ，冰乙酸2ml ，加水至 20ml 。【器材】1. 夾心式電泳槽2. 轉(zhuǎn)移電泳槽3. 電泳儀5文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯.歡迎下載支持【實驗材料】1 .人血清2 .硝酸纖維素膜三、實驗步驟I SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1 .灌膠前的準備：將兩塊玻璃板洗凈晾干或用吹風(fēng)機吹干，嵌入本體的 凹槽中，長玻板朝外，短玻板朝內(nèi)，兩塊玻璃板之間就形成了凝膠室。合上 滑塊，擰螺栓鎖緊凝膠室，檢查凝膠室底部是否與本體底端重合。然后將以 上組合放入制膠架

10、，插入并旋轉(zhuǎn)凸輪，即可灌膠。2.配制膠液膠液濃度分離膠濃縮膠12%4%30%貯備液(ml)3.20.53分離膠緩沖液(ml)2一濃縮膠緩沖液(ml)一1.0由烝水(ml)2.662.3610%SDS(ul)8040混勻后再加入以下試劑：10%TEMED(ul)804010 %過硫酸俊(ul)4020總體積(ml)843. 灌 膠 ：將配制好的分離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中，待膠液加至距短玻璃板頂端約 1.5cm 處時停止灌膠，然后在膠液表面上小心加入厚約 0.5cm 的水層，以保持分離膠面平整，同時隔絕空氣，空氣中的氧對凝膠的聚合有阻礙作用。待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時，說明分離膠已聚合

11、 ，大約 30min 完成聚合。傾去分離膠上層的水，將配制好的濃縮膠液加到分離膠上，至接近短玻璃板的頂端 ，插上樣品梳，放置待其聚合。4. 配制電極緩沖液： 甘氨酸 14.1g ， SDS 0.5g ， Tris 3g ， 加水至 1000ml ，pH8.3 。每組配 1000ml 。5. 制 樣：5川人血清，力口 45 M水，再加50川加樣緩沖液。沸水浴加熱8 分鐘， 10000rpm 離心 2 分鐘 ,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白質(zhì)分子量標準樣品。6. 加 樣 ： 1 、加入電極緩沖液；a) 拔出樣品梳；b)選3個樣品槽，用微量進樣器加樣，中間槽加入 5川分子量標準蛋白樣品，兩旁

12、槽各加入10 d人血清樣品。 穩(wěn)壓120V電泳，當(dāng)澳酚藍前沿到達距底部 0.5cm 左右時，停止電泳。7. 切 膠 ：根據(jù)切割線，先豎切后橫切，寬膠條為兩泳道，含人血清樣和分子量標準蛋白樣，考馬斯亮藍R-250 全蛋白染色。窄膠條為一泳道，為人血清樣，轉(zhuǎn)印后對目標蛋白免疫染色。8. 膠條保存： 將兩個膠條用保鮮袋包好， 貼上標有自己名字的標簽 -20 凍存。n轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上1. 將帶有人血清和標準蛋白的寬膠帶用考馬斯亮藍R250 染色、脫色：將寬膠條放到培養(yǎng)皿中， 用蒸餾水清洗后， 加入約 10ml 考馬斯亮藍R-250 染色液染色 1 小時左右，然后換成脫色液脫色，不時搖動。更換

13、幾次脫色液，至背景無色透明，條帶清晰為止。2. 放置 NC 膜和膠條：a) .切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤。b) .準備2張濾紙和海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。c) 打開轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：a. 一張浸濕的海綿 b. 一張浸濕的濾紙 c. 用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠， 并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d) 硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標明電泳方向 e. 一張浸濕的濾紙 f. 一張浸濕的海綿。3. 轉(zhuǎn) 移：小心地合上膠板，按膠側(cè)為負極，膜側(cè)為正極的方向放入轉(zhuǎn)移電泳槽中，加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。插好轉(zhuǎn)移電泳裝置的電極，打開電泳儀開關(guān)調(diào)至穩(wěn)壓 60V ，電

14、泳 1h ，轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。m膜的酶聯(lián)免疫染色1. 封閉：用 TBS 緩沖液洗膜1min 后，將膜封入塑料薄膜袋內(nèi)，留一開口。加封閉液 1ml 后封閉開口， 37 搖床上搖動 30min 。2. 加封閉液及抗體a)與第一抗體結(jié)合(1) 棄封閉液，加入適當(dāng)稀釋的 1ml 第一抗體溶液(兔抗人 IgG) ，封口后 37 搖床上輕輕搖動50min9文檔來源為：從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word版本可編輯.歡迎下載支持(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋內(nèi)。b)與酶標第二抗體結(jié)合(3)加入適當(dāng)稀釋的1ml辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG , 37 c搖床上輕

15、輕搖動50min 。(4)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min ,最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20 。加底物溶液顯色將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉(zhuǎn)入水中保存。3.結(jié)果分析：在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相，并分析結(jié)果。測量分子量標準蛋白 的遷移距離，作出標準曲線，再測出硝酸纖維素膜上的人IgG帶的遷移距離, 在標準曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實驗結(jié)果：做標準蛋白曲線的的凝膠的總長為7.53cm條帶1條帶2條帶3條帶4條帶5條帶6蛋白條帶標準分子量Mr/KDa66.245.035.025.018.414.4logMr1.821.651.541

16、.401.261.16蛋白質(zhì)條帶遷移距離/cm1.582.413.14.185.155.827相對遷移率0.210.320.420.560. 680.77帶有人血清IgG的硝酸纖維素膜的總長為7.24cmIgG輕鏈遷移距離/cmIgG輕鏈相對遷移率IgG重鏈遷移距離/ cmIgG重鏈相對遷移率數(shù)值4.080.562.380.33由公式 y = -1.1451x + 2.0366 知:當(dāng)x （重鏈相對遷移率）=0.33時，y=1.6587 得IgG重鏈相當(dāng)分子量為：45.57KDa當(dāng)x （輕鏈相對遷移率）=0.56時，y=1.3953 得IgG輕鏈相當(dāng)分子量為：24.85KDa討論：一、實驗注意

17、事項：1.丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有神經(jīng)毒性， 注意不要沾在皮膚上，如有沾染可 用水洗凈。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 電泳槽只能用水沖洗，不能用刷子刷，以免刷斷鉆電極絲；注意保護玻璃板。3. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較強、靈敏度高，但易產(chǎn)生非特異性的背景；單克隆抗體識別抗原特異性較好，但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位，且易發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點的混合單克隆抗體近年 特別被推薦，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結(jié)合11文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯.歡迎下載支持

18、并不易出現(xiàn)交叉反應(yīng)的單克隆抗體混合構(gòu)成。4. .如果反應(yīng)靈敏度不高， 可增加凝膠的厚度到 1.5mm （厚度超過2.0mm 時，凝膠轉(zhuǎn)移效率受限） ；也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。5. 濾紙 / 凝膠 / 轉(zhuǎn)印膜 / 濾紙夾層組合中不能存在氣泡， 可用玻璃棒在夾層組合上滾動將氣泡趕出，以提高轉(zhuǎn)膜效率；上下兩層濾紙不能過大，避免導(dǎo)致直接接觸而引起短路。6. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景， 可觀察僅用二抗單獨處理轉(zhuǎn)印膜所產(chǎn)生的背景強度，若高背景確由二抗產(chǎn)生，可適當(dāng)降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時間；并考慮延長每一步的清洗時間。7. 一抗與二抗的稀釋度、作用時間和溫度對檢測不同的蛋白要求不同，須經(jīng)預(yù)實驗確定最佳條件。8. 一般情況使用0.45 的NC膜，0.10.2仙m的小孔徑膜只適合于分子量小于 20kD 的蛋白質(zhì)。二、實驗思考題：1. 12% 的分離膠適合分離多少分子量范圍的蛋白質(zhì)？答：由分子克隆中的分離膠濃度與蛋白質(zhì)分子量線性關(guān)系圖知， 12% 的分離膠適合分離分子量范圍在15-60KDa 的蛋白質(zhì)。2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用 ?答： SDS-PAGE 中樣品液和濃縮膠選 TRIS/HCL 緩沖液， 電極液選 TRIS/ 甘