從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌志賀氏菌檢測操作程序討論稿

1、從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌、志賀氏菌檢測操作程序一、目的本程序用于對從業(yè)人員健康體檢進(jìn)行沙門氏菌、志賀氏菌檢測等致病 菌檢測的方法，以規(guī)范操作程序，保證檢測數(shù)據(jù)的有效性。二、適用范圍：本方法適用于從人體糞便中沙沙門氏菌、志賀氏菌的分離、鑒定及保 存的梯相關(guān)操作。三、生物安全要求標(biāo)本及相應(yīng)的致病菌操作必須在BSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全 柜中進(jìn)行。四、試劑及儀器設(shè)備4.1 試劑采便盒、Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基、亞硒酸增菌液（SF）、改良亞硒酸鹽 磺綠增菌肉湯（SBG）、沙門志賀培養(yǎng)液、木糖-賴氨酸-脫氧膽酸瓊脂（XLD）、麥康凱瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、結(jié)晶紫沙門培養(yǎng)基（YS）、 三糖鐵（T

2、SI）、動力即朵-尿素培養(yǎng)基（MIU）、沙門氏菌屬診斷血清、 志賀氏菌屬診斷血清、API20E生化試劑條、磁珠菌種保存管4.2 儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、微生物鑒定儀五、采樣方法5.1 標(biāo)本應(yīng)為新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blaii運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭運(yùn) 送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不Cary-Blair子，最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移到. 是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采用。5.2 糞便標(biāo)本：應(yīng)采集自然排出的新鮮糞便，取稀水樣、粘血樣、膿 血樣，黏液樣部分。盛于清潔、干燥、無吸水性的無菌容器，避免混 入尿液、水和其他物質(zhì)。5.3 肛拭標(biāo)本：若無法獲得糞便（如排便困難或嬰幼兒），也可以采 用肛拭子，即無菌棉拭子用生

3、理鹽水濕潤后，插入肛門內(nèi)4-5cm處兒 童約2-3cm）,同一方向輕輕旋轉(zhuǎn)2-3周。以目測能見到糞便為準(zhǔn)。插 入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基。5.4 標(biāo)本采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，若室溫保存，不能超過lh； 如不能立即送檢，應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中冷臧條件下24小 時(shí)內(nèi)送檢。六、檢驗(yàn)程序糞便標(biāo)本或肛r SBG增菌XLD或麥康凱或顯色平板XLDMIU和可疑菌落接種TSINIIUTSI和可疑菌落接種生化符合者做血清凝集和生化符合者做血清凝集和系系統(tǒng)生化反應(yīng)統(tǒng)生 化反應(yīng)菌株保存管保存菌株上送七、操作步驟.7.1分別標(biāo)記一個(gè)XLD平板（或YS平板、麥康凱平板）和1管9ml改良亞硒酸

4、鹽磺綠增菌肉湯（SBG）（或SF增菌液或沙門志賀培 養(yǎng)液）。7.2 用1個(gè)無菌拭子取少量標(biāo)本（不要使拭子粘得太多，盡量從 可見血或黏液的部位收集）接種在XLD平板的第一區(qū)，接著把拭子 放入SBG增菌液。再滅菌接種環(huán)在XLD平板的其余區(qū)進(jìn)行劃線接種。 如果是Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子，則輕攪混合標(biāo)本后接種增 菌液與平板。7.3 所有培養(yǎng)基均放入36±1培養(yǎng)，SBG的最佳增菌時(shí)間是 16-18h （建議每天下午45時(shí)接種標(biāo)本，第二天早上810時(shí)用增菌 液劃平板）。7.4 觀察平板：取培養(yǎng)后的平板，觀察有無可疑菌落。7.4.1 XLD平板可疑菌落觀察：志賀菌在XLD平板上為粉

5、紅或無 色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形菌落，直徑而大部 分的大腸桿菌類的菌落為黃色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī) 則，直徑2-3mm。大多數(shù)沙門菌在XLD平板上中心黑色的透明、光 滑、濕潤、邊緣整齊、圓形的菌落。（圖2）74 2 YS平板可疑菌落觀察：7.4 . 3麥康凱平板可疑菌落觀察：志賀菌在麥康凱平板上為無色至淺 粉色、半透明、光滑、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則、圓形菌落，直徑 2-3mm；大多數(shù)沙門菌為無色菌落，粉紅色，帶或不帶黑心，傷寒沙 混濁、而大部分的大腸桿菌類的菌落為粉紅或紅色、門菌為無色菌落;o凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則，直徑3-4mniXLE小時(shí)后，劃線 接種7.4.

6、 4 SBG肉湯增菌：SBG增菌1618。沙門顯色平板24h平 板或沙門顯色平板，放入36 ± 1 °C培養(yǎng)18直徑典型的沙門菌在沙 門顯色平板上為紫色的菌落，可疑菌落觀察：。2-3111111建議的初步 篩查方案（初步生化特征見表7.4.4 1）：表1沙門菌、傷寒沙門菌、志賀菌及常見腸道菌的初步生化特征大部分沙門菌K （斜 面）TSI傷寒志賀 菌氏沙門菌枸椽酸變大腸桿菌 桿桿菌K （紅色）A （黃色）A （黃色）+ （黑色）（紅色）K （紅色）（黃色）A （黃色）小部分-（彌漫-（沿接種生 長）線生長）-（黃色-（黃色圓環(huán)）圓環(huán)）（黃色）AK （紅色）A （黃色）AA （

7、黃色）A （黃色）（Oi）tsi-+ （黑色）+（黑色）STS工（HX+（氣 泡）（產(chǎn)氣）TSI + （彌漫 + MIU （動力）生長）-（黃 色 MIU <W>+ （氣泡）+ （氣泡）+ （氣泡）+（彌漫+（彌漫+（彌漫 生長）生長）+（加試劑黃色變 紅色）圓環(huán)）+ （紅色）生長）+ （加試劑變紅色）圓環(huán)）M2（尿素）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）XLD分離YS分離A：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌接種TSI和MIUB：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌接種TSI和MIUC：糞便（或肛拭子）和TSI接種 分離SBG或SF增菌XLD和麥康凱MIUSBG或SF增菌

8、：糞便（或肛拭子） YS和沙門顯色D分離 接種TSI和MIUE：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌XLD和沙門顯色分離接種TSI和MIU7.5 生化初步鑒定每個(gè)平板挑取35個(gè)分離較好的單個(gè)可疑菌落，分別接種到三糖鐵 （TSI）和動力弓I睬-尿素培養(yǎng)基（MIU）, 36c ±1培養(yǎng)1824鼠沙門菌和志賀菌的生化特征見表207.6 系統(tǒng)生化試驗(yàn)沙門菌和志賀菌初步鑒定陽性菌經(jīng)轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂單，取單個(gè)菌落進(jìn)行 系統(tǒng)生化鑒定（可以使用APE20E或全自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行）。7.7 血清學(xué)試驗(yàn)7.7.1 志賀菌血清學(xué)試驗(yàn)1.1 .1.1挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合志賀菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用四種多 價(jià)血清做

9、玻片凝集反應(yīng)（4種多價(jià)包括： A群1、2型；B群和D群）。 凝集者則用B群多價(jià)、D群和Al、A2、血清分別凝集。7.7 .L2若多價(jià)血清不凝集，可能為C群或A群的312型，應(yīng)進(jìn)行 C群的四種多價(jià)和A群另三種多價(jià)血清做玻片凝集。7.7.2 沙門菌血清學(xué)試驗(yàn)7.7.2.1 挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合沙門菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用A-F 群O多價(jià)血清做玻片凝集反應(yīng)。09-010-04因子檢出頻率，按照O若凝集可按常見772.2.07-08-019-02-011 順序凝集。7.7.2.3 H抗原凝集7.7.3所有凝集陽性的菌落，都要同時(shí)用生理鹽水做凝集試驗(yàn)，只有 不出現(xiàn)自凝時(shí)，才可以報(bào)告陽性結(jié)果。8結(jié)果報(bào)告8.1 在初步生化鑒定符合后，可以先將可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，最 后綜合生化及血清學(xué)結(jié)果，可以報(bào)告檢出（或未檢出）沙門菌（或志 賀菌）。8.2 對于從業(yè)人員體檢結(jié)果己經(jīng)納入檢驗(yàn)軟件管理的單位，可以直接 在檢驗(yàn)軟件中錄入相應(yīng)結(jié)果。8.3 其他單位可以設(shè)計(jì)專門的報(bào)告格式反饋給送檢單位或送檢科室, 檢驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)至少包括姓名，性別，年齡，體檢編號，檢測結(jié)果。8.4 檢測結(jié)果為陰性，可以報(bào)告為未檢出腸道沙門菌和志賀菌；檢測 結(jié)