最新微生物菌種資源純度檢測技術(shù)規(guī)程

1、微生物菌種資源純度檢測技術(shù)規(guī)程目次前 言 2引 言 31 范圍 42 術(shù)語、定義、縮略語和符號(hào) 43 菌種的純度檢測 4參考文獻(xiàn) 8前言本規(guī)范由科學(xué)技術(shù)部農(nóng)村與社會(huì)發(fā)展司提出。本規(guī)范起草單位： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所、 中國科學(xué)院微生物研究所、 中國林 業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所、 中國藥品生物制品檢定所、 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研 究所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。本規(guī)范主要起草人：張曉霞、姜瑞波、顧金剛、康孟佼、李世貴、張瑞穎、阮志勇、周 宇光、樸春根、葉強(qiáng)、張?jiān)虑?、陳敏、程池等。引言微生物菌種資源種類繁多， 需要針對不同的微生物類群建立簡便有效的形態(tài)學(xué)、 生物化

2、 學(xué)等標(biāo)準(zhǔn)化的純度檢測技術(shù)。 微生物菌種純度檢測是微生物菌種進(jìn)行鑒定、 保存、 評價(jià)和利 用的前提條件，是確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和資源保藏質(zhì)量的基本保障。制定本規(guī)程的目的是為健全質(zhì)量保證管理體系， 保證微生物菌種資源的質(zhì)量， 規(guī)范各類 微生物菌種資源純度檢測。微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程1 范圍本規(guī)程規(guī)定了古菌、細(xì)菌、真菌、病毒（種）純度檢測的程序和方法。 本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機(jī)構(gòu)、大學(xué)、企業(yè)、個(gè)人等。2 術(shù)語、定義下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程2.1純度檢測 purity check指通過適當(dāng)?shù)姆椒z測菌種是否為純培養(yǎng)物。2.2純培養(yǎng) pure culture由單個(gè)細(xì)胞的后代組

3、成的培養(yǎng)物， 即單細(xì)胞培養(yǎng)物或無性繁殖系。 通常是由挑取單個(gè)菌 落或利用單胞分離技術(shù)，移種繁殖獲得。3 菌種的純度檢測3.1 古菌和細(xì)菌的純度檢測3.1.1 菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上， 將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線， 適宜培養(yǎng)后， 同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應(yīng) 再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。3.1.2 細(xì)胞形態(tài)對數(shù)生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性； 細(xì)胞形狀、 大小、 莢膜等特征應(yīng)相 似3.1.3 芽孢大小、位置、形狀宜檢測樣品是否形成芽孢，對形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應(yīng)相似

4、。3.2 放線菌菌種純度檢測3.2.1 菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線 , 挑取單菌落，適宜培養(yǎng)后， 在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質(zhì)地、光澤、顏色等應(yīng)相似。如懷疑為細(xì)菌污 染，則 30液體培養(yǎng) 24小時(shí)，培養(yǎng)液不應(yīng)渾濁，如渾濁則視為細(xì)菌污染。3.2.2 培養(yǎng)特征分別接種三種以上培養(yǎng)基， 在三種以上培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征應(yīng)想同， 包括氣生菌絲、 基 內(nèi)菌絲、可溶性色素的顏色等。3.2.3 孢子絲及孢囊在特定的培養(yǎng)基、 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間等條件下， 孢子著生方式、 孢子絲形態(tài)及其顏色 或孢囊著生位置（氣絲或基絲）、孢囊的形狀，大小應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。3.3 酵母菌種

5、純度檢測3.3.1 菌落形態(tài)應(yīng)對菌落形態(tài)相似性進(jìn)行檢測。 在特定的培養(yǎng)基上， 通過對待檢測菌株進(jìn)行稀釋或劃線 涂布平板獲取單菌落，一定的培養(yǎng)條件下，比較同一平板內(nèi)，菌落的大小、形狀、顏色、隆 起、表面狀況、質(zhì)地、光澤等應(yīng)一致。3.3.2 個(gè)體形態(tài)應(yīng)對檢測樣品的個(gè)體形態(tài)進(jìn)行檢測。 在指定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下， 細(xì)胞形狀、 大小及 細(xì)胞的增殖方式應(yīng)一致。3.3.3 繁殖方式酵母繁殖的方式應(yīng)一致，如是芽殖，出芽的方位、數(shù)量應(yīng)一致。3.4 絲狀真菌菌種純度檢測3.4.1 菌落特征菌落的形態(tài)等表觀特征應(yīng)一致。3.4.2 菌絲特征在特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌絲分隔、菌絲形態(tài)等應(yīng)一致。3.4.3 其他主要

6、顯微特征應(yīng)一致3.4.4 檢測是否有細(xì)菌污染3.4.5 對于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術(shù)獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行對比，其菌 絲、孢子等特征應(yīng)與原始菌株的描述一致。3.5 病毒的純度檢測3.5.1 純粹檢查應(yīng)將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（ G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過一定溫度時(shí)間培養(yǎng)后，檢查結(jié)果應(yīng)無細(xì)菌生長為純粹。3.5.2 支原體檢查檢測由禽胚組織或其細(xì)胞所培養(yǎng)的病毒應(yīng)用改良 Frey 氏培養(yǎng)基。檢測其它培養(yǎng)方法所得 病毒應(yīng)用支原體培養(yǎng)基。 任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落， 判為陽性。 陽性對照中至少 有一個(gè)平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，

7、則檢驗(yàn)有效。3.5.3 外源病毒檢查病毒類制品在毒種選育和生產(chǎn)過程中， 經(jīng)常使用動(dòng)物或細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)， 因此， 有可能造 成外源因子 （特別是外源病毒因子） 的污染。 為了保證制品質(zhì)量， 需要對毒種和細(xì)胞進(jìn)行外 源因子檢測。3.5.3.1 病毒種子批外源因子檢查對病毒主種子批或工作種子批， 應(yīng)抽取足夠檢測試驗(yàn)需要量的供試品進(jìn)行病毒外源因子 檢測。在試驗(yàn)前應(yīng)用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體） ，所用的抗體免疫源 應(yīng)采用與生產(chǎn)疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細(xì)胞（或動(dòng)物）制品。如果病毒 曾在禽類組織或細(xì)胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應(yīng)來自 SPF 雞群。 以下方法

8、可以選擇一種或多種進(jìn)行。3.5.3.1.1 動(dòng)物試驗(yàn)法3.5.3.1.1.1 小鼠試驗(yàn)法取 15 20g 小鼠至少 10 只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0.03ml ，同時(shí)腹腔接種 0.5ml。至少觀察 21 天。在觀察期內(nèi)至少有 80最初接種的小鼠存活，試驗(yàn) 才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗(yàn) 24 小時(shí)后死亡或有患 病體征的小鼠， 直接觀察期病理改變， 并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過腦內(nèi)和顱腔接種另 外至少 5 只 15 20g小鼠，并觀察 21 天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.1.2 乳鼠試驗(yàn)法取出生后 24 小時(shí)內(nèi)的乳鼠

9、至少 10 只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液， 腦內(nèi)接種 0.01ml ， 同時(shí)腹腔接種至少 0.1ml 。每天觀察，至少 14 天。在觀察內(nèi)至少有 80最初接種的乳鼠存 活，試驗(yàn)才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗(yàn) 24 小時(shí)后死 亡或有患病體征的乳鼠， 直接肉眼觀察其病理改變， 并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、 脾制備 成懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少 5 只出生后 24 小時(shí)內(nèi)乳鼠，并每天觀察至接種第 14 天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)法3.5.3.1.2.1 非血吸附檢查用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液， 接種于生產(chǎn)用的同種的細(xì)胞。

10、 細(xì)胞至少接種 6 瓶，每瓶 病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25。于 36±1培養(yǎng)，觀察 14 天，必要時(shí)可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，未見細(xì)胞病變（ CPE）為陰性，符合要求。3.5.3.1.2.2 血吸附病毒檢查上述接種病毒的各個(gè)細(xì)胞于第 6 8天后和第 14天，取出 2瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。 用 0.2 0.5%雞和豚鼠紅細(xì)胞混合菌懸液覆蓋于細(xì)胞表面，分別置于28，2025， 30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性，符合要求。3.5.3.1.3 雞胚檢查法在禽類組織或細(xì)胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用 911 日和57 日齡兩組 SPF雞胚，每組至少 5 只，

11、分別于尿囊腔和卵黃囊接種經(jīng)抗體血清中和后的 病毒懸液，每胚 0.5ml 。孵育 7 日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細(xì)胞混合懸液做血球凝集試驗(yàn) 應(yīng)為陰性。被接種的雞胚至少 80存活 7 天，試驗(yàn)有效。3.5.3.2 生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查3.5.3.2.1 細(xì)胞直接觀察每批生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)留取 5（或不少于 500ml ） , 細(xì)胞懸液不接種病毒，作為對照細(xì)胞 加入與疫苗生產(chǎn)相同的細(xì)胞維持液，置于與疫苗生產(chǎn)相同的條件下培養(yǎng)，觀察 14 天，在顯 微鏡下觀察是否有細(xì)胞病變（ CPE）出現(xiàn)，無細(xì)胞病變（ CPE）出現(xiàn)者為陰性，符合要求。在 觀察期末至少有 80的對照細(xì)胞培養(yǎng)物存活，試驗(yàn)有效。3.5.3.2.

12、2 血清吸附病毒檢查對生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查的（ 1）項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)物在觀察期末取至少25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。 （方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）參考文獻(xiàn)1 劉志恒，姜成林主編 .放線菌現(xiàn)代生物學(xué)與生物技術(shù) . 北京：科學(xué)出版社 ,Pp1-353. 20042 楊蘇聲主編 . 細(xì)菌分類學(xué) . 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社 ,Pp1-145.19973 沈萍，彭珍榮主譯 . 微生物學(xué) ，第五版，中文版 , 高等教育出版社， 20044 中國科學(xué)院微生物研究所 常見與常用真菌 編寫組 . 常見與常用真菌 . 北京： 科學(xué)出版 社 ,P1-317 ，19785 中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏手冊編著組 . 菌種保藏手冊 . 北京：科學(xué)出版 社 ,P1-839 ，19806 David R. Boone et al. Bergey' s Man