蛋白質(zhì)相互作用的主要研究方法

1、蛋白質(zhì)相互作用的主要研究方法細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號(hào)， 通過其特有的信號(hào)途徑， 調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性。 在這個(gè)過程中， 蛋白質(zhì)占有很重要的地位， 它可以調(diào)控, 介導(dǎo)細(xì)胞的許多生物學(xué)活性。 雖然有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用， 但是大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來發(fā)揮作用的。 因此， 為了更好地理解細(xì)胞的生物學(xué)活性， 必須很好地理解蛋白質(zhì)單體和復(fù)合物的功能，這就會(huì)涉及到蛋白質(zhì)相互作用的研究。在現(xiàn)代分子生物學(xué)中，蛋白質(zhì)相互作用的研究占有非常重要的地位。研究蛋白質(zhì)相互作用時(shí)要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皸l件選擇不同的實(shí)施策略。研究已知蛋白間的相互作用人

2、們關(guān)注的是蛋白間能否發(fā)生結(jié)合， 實(shí)驗(yàn)本身更趨向于驗(yàn)證性，因此，應(yīng)選擇操作性強(qiáng)、可信度高、接近生理?xiàng)l件的技術(shù)方法，盡量減少實(shí)驗(yàn)本身帶來的假陰性或假陽性。 蛋白質(zhì)相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、 Far Western blotting 、生物信息學(xué)、酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示、表面等離子共振、熒光能量轉(zhuǎn)移等幾種。1 免疫共沉淀免疫共沉淀（ Co-Immunoprecipitation ） 是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。 是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是: 細(xì)胞裂解液中加入抗體， 與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗

3、脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGEWesternblotting 分析。免疫共沉淀既可以用于檢驗(yàn)已知的兩個(gè)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的相互作用， 也可以找出未知的蛋白質(zhì)相互作用， 不管是兩者的哪個(gè)， 其原則都是一樣的，都需要用特異性的抗體與其中的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，之后通過蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G瓊脂糖微珠將復(fù)合物沉淀下來，然后用SDS-PAGE定。免疫共沉淀中設(shè)置正確的 對(duì)照非常重要， 因?yàn)樵摲椒赡艹霈F(xiàn)假陽性的概率比較高， 設(shè)置的對(duì)照包括： 在 對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。在免疫共沉淀試驗(yàn)中要保證試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（ 1）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉

4、淀得到的， 而并非外源非特異蛋白。 單克隆抗體的使用有助于避免污染的產(chǎn)生。（ 2）要確保抗體的特異性。即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀。( 3)確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中， 而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的。 這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。免疫共沉淀試驗(yàn)也同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物是否為直接相互作用的兩種蛋白。例如E1Mp60的共沉淀就是間接的相互作用。其實(shí)際上是E1AWp107直接相互作用，而p107與p60直接相互作用的結(jié)果。與蛋白親和色譜相比，免疫 共沉淀試驗(yàn)的靈敏度不夠高。這與抗原濃度較低有關(guān)，但如果使抗原過量表達(dá)，又會(huì)破壞相互作用的天然狀態(tài)。免疫共沉淀是檢測(cè)

5、蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法， 也是較常用的方法。 它的優(yōu)點(diǎn)是： 與蛋白親和色譜一樣， 檢測(cè)的產(chǎn)物是粗提物； 抗原與相互作用的蛋白以細(xì)胞中相類似的濃度存在， 避免了過量表達(dá)測(cè)試蛋白所造成的人為效應(yīng)； 蛋白以翻譯后被修飾的天然狀態(tài)存在；復(fù)合物以天然狀態(tài)存在。Schaerer與他的同事們 利用免疫共沉淀技術(shù)研究了 GABAA體蛋白與多功能蛋白gC1q-R之間的相互作 用，與酵母雙雜交試驗(yàn)得到的結(jié)果完全相同。其缺點(diǎn)是免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白， 而是通過第三者間接相互作用的蛋白， 另外， 其靈敏度不及蛋白親和色譜高， 因?yàn)楦信d趣的蛋白濃度不如后者高，這樣驅(qū)動(dòng)復(fù)合物形成的能力小。免疫共沉淀

6、的結(jié)果初步提示PKCx 和IGF1M能發(fā)生相互作用。但這種方法有兩個(gè)缺陷：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可 能不是直接結(jié)合， 而可能有第三者在中間起橋梁作用； 二是必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果， 方法本身具有冒險(xiǎn)性。 為了解決免疫沉淀的這些問題， 本實(shí)驗(yàn)制備了高效價(jià)的抗體來提高其靈敏度，此外還加大蛋白質(zhì)A或G以及抗體的量，并將最后得到的蛋白進(jìn)行濃縮，以便盡可能地得到較清晰的電泳條帶。同時(shí)，結(jié)合Far-Westernblotting等技術(shù)就可以彌補(bǔ)IP技術(shù)的不足，來證明兩種蛋白質(zhì)是否直接作用。2 Far-Western blottingFar-

7、Western印跡最初發(fā)明用于32P標(biāo)記的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-融合蛋白表達(dá)文庫的篩選，現(xiàn)在則用于檢測(cè)蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用。最近幾年，F(xiàn)ar-Western 還用于檢測(cè)受體-配體相互作用以及相互作用蛋白文庫的篩選。 借助這種分析方法，使許多研究變成可能，如翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用的影響， 用合成的多肽作探針檢測(cè)蛋白相互作用的序列、 以及在無抗原特異性抗體的情況下識(shí)別蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用。Far-Western 印跡技術(shù)與Western 印跡十分相似。在Western 印跡中，運(yùn)用抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)移膜上的相應(yīng)抗原。 在經(jīng)典 Far-Western 印跡中， 運(yùn)用經(jīng)標(biāo)記的或可

8、被抗體檢測(cè)的“誘餌”蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。用 SDS-PAGE十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)或非變性PAG分離含有未知靶蛋白的樣品(通常為細(xì)菌裂解液) 然后轉(zhuǎn)膜。 靶蛋白附于轉(zhuǎn)移膜表面時(shí)可以被檢測(cè)到。 轉(zhuǎn)膜后，封閉膜，用一已知誘餌蛋白(通常用純品)進(jìn)行探測(cè)。誘餌蛋白與靶蛋白反應(yīng)后，運(yùn)用該誘餌蛋白的特異性檢測(cè)系統(tǒng)即可檢測(cè)出相應(yīng)條帶。3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的生物信息學(xué)方法主要包括以下九種方法： 系統(tǒng)發(fā)育譜 (phylogenetic profile) 、基因鄰接(gene neighborhood) 、基因融合事件(gene fusion event) 、 鏡像樹 (

9、mirror tree) 、 突變關(guān)聯(lián) (correlated mutation) 、序列信號(hào)關(guān)聯(lián)(correlated sequence-signatures) 、保守的蛋白間相互作用(interologs) 、同源結(jié)構(gòu)復(fù)合體(homologous structural complexes) 、進(jìn)化速率關(guān)聯(lián) (correlated evolutionary-rate) 。以上描述的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的生物信息學(xué)方法還不完善， 但預(yù)期是非常有前途的， 特別是隨著原始蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的積累， 生物信息學(xué)注釋手段的運(yùn)用會(huì)愈顯重要， 相信會(huì)有更多的生物信息學(xué)算法開發(fā)出來。 對(duì)目前已有的多種生物信息學(xué)方法

10、的比較和評(píng)估是另一項(xiàng)急待開展的工作， 遺憾的是， 這方面的文獻(xiàn)不多，主要原因是缺乏作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 因此， 開發(fā)高質(zhì)量的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫- 分析工具 - 信息抽提方法， 以及建立數(shù)據(jù)庫之間信息交換的標(biāo)準(zhǔn)尤顯重要。4 酵母雙雜交系統(tǒng)20世紀(jì) 80年代中、后期， 真核轉(zhuǎn)錄因子得到大量深入的研究， 這類研究最終促成了酵母雙雜交系統(tǒng)的誕生。當(dāng)時(shí)的研究發(fā)現(xiàn)，真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)( DNA-binding domain， BD) 和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)( transcription activation domain， ADD在功能上和實(shí)質(zhì)上都是可分的。BDt時(shí)巴蛋白定位到基因組特定DN府列

11、上， ADfg夠使轉(zhuǎn)錄裝置?脫活基因轉(zhuǎn)錄。Brent和Ptashne于198就證實(shí)，將2種不同蛋 白的BDf ADt組，仍能產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了轉(zhuǎn)錄因子的 特性。后來，一些研究人員發(fā)現(xiàn) ADF口B必在1條多肽上。當(dāng)這兩個(gè)區(qū)域單獨(dú)存 在時(shí)均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當(dāng)它們?cè)陂g上彼此聯(lián)系時(shí)，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。Field和SongiE是利用這一特性建立了酵母雙雜交系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上 是組件式的，即這些因子往往由2個(gè)或2個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。GAL北白 是1個(gè)基因轉(zhuǎn)錄激活子（ 由它激活轉(zhuǎn)錄的基因可以編碼半乳糖苷酶） 。它包括2個(gè)分離的功能性結(jié)構(gòu)域：1個(gè)能結(jié)合特異DN府列（

12、UASG）IN末端結(jié)才域和1個(gè)包含酸性 區(qū)域的C末端結(jié)構(gòu)域，它是轉(zhuǎn)錄激活所必需的。雙雜交系統(tǒng)是這樣建立的：GAL4的DN船合結(jié)構(gòu)域，與X白質(zhì)融合；GAL4勺激活結(jié)構(gòu)域，與蛋白質(zhì)Y融合；X和Y 形成一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物，重新形成GAL結(jié)構(gòu)域的鄰近效應(yīng)，即實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子功 能重建，導(dǎo)致UAS郵空的基因（報(bào)告基因）開始轉(zhuǎn)錄。他們當(dāng)時(shí)還用2種已知的能 與SNF和SNF4T作的酵母蛋白質(zhì)檢驗(yàn)了這個(gè)系統(tǒng)，只有當(dāng)2個(gè)融合蛋白都出現(xiàn)在1 個(gè)細(xì)胞中時(shí)才能獲得高的轉(zhuǎn)錄活性。酵母雙雜交白原理是將2個(gè)目的蛋白分別與ADffiBDi合產(chǎn)生新的融合蛋白， 如果這2個(gè)目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會(huì)促使ADF口 BD互相靠

13、近而產(chǎn)生 有活性的轉(zhuǎn)錄因子， 進(jìn)而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。 在這 以前 , 也有許多生物化學(xué)方法用來研究蛋白質(zhì)間相互作用 , 但都是在體外研究, 該系統(tǒng)可以在酵母這種生長(zhǎng)迅速且易操作的體系中研究真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用，且通過cDNAt庫篩選直接找到與未知蛋白質(zhì)相互作用的蛋白基因。酵母雙雜交系統(tǒng)與其衍生系統(tǒng)的操作程序是類似的， 其基本操作程序大體包括以下幾個(gè)步驟：選擇合適酵母作為篩選未知蛋白的受體菌；誘餌蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定； 誘餌蛋白自身轉(zhuǎn)錄活性分析； 獵物蛋白cDNA文庫 的構(gòu)建； 酵母雙雜交篩選與陽性克隆鑒定。 這是篩選相互作用蛋白的基本步驟，如果需要利

14、用雙雜交進(jìn)行其他方面的研究，可根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行相應(yīng)地調(diào) 整。酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、 直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點(diǎn)： 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn) 錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNAC庫, 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞

15、細(xì)胞部位及功能的蛋白。酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白 -蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)， 而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、 二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽性”。 由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA1合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu) 域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他

16、蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 從而引起報(bào)告基因的表達(dá)， 產(chǎn)生 假陽性 結(jié)果。針對(duì)“假陽性”問題 , 研究者在實(shí)踐中通過對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)出現(xiàn)了雙篩選系統(tǒng)和假陽性顯示分析法等。另外, 近幾年來已初步建立了哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng) , 它能更好地模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境, 從而探明蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理。同時(shí),為了克服酵母雙雜交系統(tǒng)中存在的第 1個(gè)問題 , 這些年來 , 人們開始嘗試使用其他 蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來建立新的雙雜交系統(tǒng)。于是, 一些不依賴于轉(zhuǎn)錄因子活性的新型雙雜交系統(tǒng)相繼建立, 如分離的泛素系統(tǒng)、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析、阻遏物重構(gòu)分析和SOS恢復(fù)系統(tǒng)等。此后在酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上還發(fā)展出酵母單雜交系統(tǒng)、雙誘餌系

17、統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、哺乳類雙雜交系統(tǒng)等多種方法，并且還出現(xiàn)了用 大腸埃希菌做為替代的雙雜交系統(tǒng)。5 噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是一種噬菌體表面表達(dá)篩選技術(shù), 也是一種用于篩選和改造功能性多肽的生物技術(shù)。在編碼噬菌體的外殼蛋白基因上連上1個(gè)單克隆抗體的基因序列 , 當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)時(shí), 表面就會(huì)表達(dá)出相應(yīng)的單抗, 將噬菌體過柱, 由于柱 上含有目的蛋白 , 所以會(huì)特異性結(jié)合相應(yīng)抗體。 因此 , 噬菌體展示技術(shù)使得表達(dá)蛋白 ( 表達(dá)型 ) 和編碼基因 ( 基因型 ) 之間完美的聯(lián)系起來, 而且 , 它也能很好地解決酵母雙雜交系統(tǒng)中存在的問題。噬菌體 展示技術(shù)具有兩 點(diǎn)最顯著 的意義 ：一 點(diǎn)是它 引 伸

18、出 了分子庫 (molecular repertoires) 的概念；而另一點(diǎn)則是此項(xiàng)技術(shù)克服了研究蛋白質(zhì)相互作用時(shí)需基于對(duì)其結(jié)構(gòu)的詳盡知識(shí)的限制 , 這也是使得該項(xiàng)技術(shù)得以愈來愈廣泛運(yùn)用的直接原因。目前, 利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建隨機(jī)肽庫、蛋白質(zhì)庫和抗體庫研究受體或抗體的結(jié)合位置, 改造和提高蛋白質(zhì)、酶和抗體的生物學(xué)和免疫學(xué)屬性 , 研究用于檢測(cè)治療用途的新型多肽藥物、 疫苗和抗體等, 都具有廣闊的應(yīng)用前景。6 表面等離子共振目前 , 表面等離子體共振( Surface Plasmon Resonance) 技術(shù)已成為了當(dāng)今一種全新的研究蛋白質(zhì)之間相互作用的手段。表面等離子體共振SP作物傳感器是利用表面等離子體共振現(xiàn)象和SPR譜峰對(duì)金屬表面上電介質(zhì)變化敏感的特點(diǎn) , 通過將受體蛋白固定在金屬膜上, 檢測(cè)受體蛋白與液相中配體蛋白的特異性結(jié)合。SPR技術(shù)的特點(diǎn)是測(cè)定快速、安全、不需標(biāo)記物或染料及靈敏度高。 其除了應(yīng)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)外 , 還可檢測(cè)蛋白質(zhì)-核酸及其他生物大分子之間的相互