土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)(上課)..

1、思考思考2該培養(yǎng)基對微生物該培養(yǎng)基對微生物 （具有，（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機制是機制是 。具有具有只有能夠以尿素作只有能夠以尿素作為氮源的微生物才為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生能在該培養(yǎng)基上生長長（比例計數(shù)法）（比例計數(shù)法）待測樣品待測樣品等量的已知含量的紅細胞等量的已知含量的紅細胞 混勻混勻涂抹涂抹測定：測定： 紅細胞數(shù)目紅細胞數(shù)目細菌數(shù)目細菌數(shù)目計算單位體積內的細菌數(shù)目計算單位體積內的細菌數(shù)目 將含已知數(shù)目的紅細胞液體與待測的菌液按將含已知數(shù)目的紅細胞液體與待測的菌液按1：1均勻混合，在顯微鏡下數(shù)出各自的數(shù)目，然后求菌液均勻混合，在顯

2、微鏡下數(shù)出各自的數(shù)目，然后求菌液中的細胞數(shù)目。中的細胞數(shù)目。細菌細菌紅細胞紅細胞【補充】顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法?！狙a充】顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法。舉例：已知紅細胞濃度為舉例：已知紅細胞濃度為M個個/mL，從，從體積為體積為N mL的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大桿的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大桿菌液與紅細胞液等量均勻混合后，涂片，染菌液與紅細胞液等量均勻混合后，涂片，染色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細胞色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細胞W個，個，大腸桿菌大腸桿菌Y個，求個，求NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數(shù)桿菌的個數(shù)X是多少？是多少？XNM YW(個個)觀察到的紅細胞平

3、均數(shù)觀察到的紅細胞平均數(shù)/觀察到的細菌平均數(shù)觀察到的細菌平均數(shù)紅細胞含量紅細胞含量/細菌含量細菌含量 公公 式式 恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵，恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵，如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？樣品中的菌落數(shù)？ 統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算值，然后按課本旁欄的公式進行計算教材教材P22實例分析實例分析P22 你認為哪個同學的結果更接近真實你認為哪個同學的結果更接近真實值？

4、值？ 你認為這兩位同學的實驗需要改進你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？嗎？如果需要，如何改進？實例分析實例分析P22 第一同學只涂布了一個平板，第一同學只涂布了一個平板，沒有設置沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。重復組，因此結果不具有說服力。 第二位同學考慮到設置重復組的問題，第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了三個平板，但是涂布了三個平板，但是其中其中1個平板的計個平板的計數(shù)結果與數(shù)結果與2個相差太遠，說明在操作過程個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將將3個平板的計數(shù)值用來求平均值個平板的計數(shù)值用來求平均

5、值。菌落計數(shù)菌落計數(shù)配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀釋系列稀釋涂布平板涂布平板與培養(yǎng)與培養(yǎng)根據(jù)圖示根據(jù)圖示27填寫以下實驗流程：填寫以下實驗流程：試驗設計：試驗設計： 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。用前都要滅菌。 制制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。 準備準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和和選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基將菌將菌液稀釋相

6、同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照對照，用來，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。每個。每個稀釋度下需要稀釋度下需要3 3個個選擇培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基，1 1個牛肉膏蛋白胨個牛肉膏蛋白胨

7、培養(yǎng)基，因此共需要培養(yǎng)基，因此共需要1515個選擇培養(yǎng)基，個選擇培養(yǎng)基，5 5個牛肉個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8 8個個滅菌的試滅菌的試管和管和1 1個個滅菌的移液管。滅菌的移液管。 由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。每個稀釋度下需要。每個稀釋度下需要3 3個個選擇培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基，1 1個牛肉個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要1515個選擇培養(yǎng)基，個選擇培養(yǎng)基，5 5個牛肉

8、膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8 8個個滅滅菌的試管和菌的試管和1 1個個滅菌的移液管。滅菌的移液管。 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？實驗時要實驗時要對培養(yǎng)皿作對培養(yǎng)皿作好標記。注好標記。注明培養(yǎng)基類明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時型、培養(yǎng)時間、稀釋度、間、稀釋度、培養(yǎng)物等。培養(yǎng)物等。 當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在3030300

9、300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對至少對3 3個平板進行重復計數(shù)，然后求出個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。算出樣品中細菌的數(shù)目。 關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。 關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。 關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質

10、關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。 關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。 關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質關注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。地等等，都是區(qū)分細菌的重要手段。 思考在研究未知微生物時務必規(guī)范操作，思考在研究未知微生物時務必規(guī)范操作，以防被以防被致病微生物致病微生物感染，實驗后一定要洗手。感染，實驗后一定要洗手。（六）鑒定（六）鑒定：篩選后必鑒定：篩選

11、后必鑒定 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化加入某種指示劑或化學藥品，不影響微生物的生存學藥品，不影響微生物的生存1 1、酚紅培養(yǎng)基：、酚紅培養(yǎng)基： 鑒定分解尿素的細菌。鑒定分解尿素的細菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強培養(yǎng)基堿性增強 酚紅變紅酚紅變紅脲脲酶陽性酶陽性2 2、伊紅、伊紅美藍培養(yǎng)基：美藍培養(yǎng)基： 鑒定大腸桿菌。鑒定大腸桿菌。 原理：代謝產物與伊紅原理：代謝產物與伊紅美藍美藍結合結合 菌落呈深紫色并帶有金屬光菌落呈深紫色并帶有金屬光澤。澤。伊紅伊紅美藍培養(yǎng)基美藍培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，

12、因用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，因為的為的代謝產物與伊紅代謝產物與伊紅美藍結合美藍結合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。制其他微生物的生長。例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 課題成果與評價課題成果與評價 （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染

13、以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。出一些菌落。如果學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結如果學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結果應該接近。如果結果相差太遠，需要進一步果應該接近。如果結果相差太遠，需要進一步分析產生差異的原因。分析產生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作是否成功（二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得

14、到了如果得到了2 2個或個或2 2個以上菌落數(shù)目在個以上菌落數(shù)目在3030300300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。進行菌落的計數(shù)。 （三）重復組的結果是否一致（三）重復組的結果是否一致課后練習課后練習 2.提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養(yǎng)基外，還應參照物除了

15、需要準備選擇培養(yǎng)基外，還應參照厭氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)方法進行實驗設計。方法進行實驗設計。六、例題解析六、例題解析 例例1 1對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是A A在液體培養(yǎng)基上進行在液體培養(yǎng)基上進行 B B至少接種一種細菌至少接種一種細菌 C C接種一個細菌接種一個細菌 DD及時補充消耗的營養(yǎng)物質及時補充消耗的營養(yǎng)物質 解析：細菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進行的。解析：細菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進行的。這些條件是：這些條件是：一種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定一種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細菌總數(shù)。時測

16、定細菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細菌的子細胞群體的變化規(guī)律表達微生物的測定時只能用一種細菌的子細胞群體的變化規(guī)律表達微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細菌總數(shù)。若接種多種細菌，則會發(fā)生種間才能通過樣品推測細菌總數(shù)。若接種多種細菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。定的接種量。答案：答案：A A1.1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正

17、確的表述是（對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.A.在液體培養(yǎng)基上進行在液體培養(yǎng)基上進行 B.B.至少接種一種細菌至少接種一種細菌 C.C.接種一個細菌接種一個細菌 D.D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質及時補充消耗的營養(yǎng)物質 2.2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.A.培養(yǎng)細菌培養(yǎng)細菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別其他微生物加以區(qū)別3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A

18、.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D4.4.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（ ） A.A.科學家從科學家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計某一稀釋度的統(tǒng)計某一稀釋度的5 5個平板的菌落數(shù)依次為個平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因設置

19、對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度 D.D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。種類最多。5.5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）加入（） A.A.較多的氮源物質較多的氮源物質 B.B.較多的碳源物質較多的碳源物質 C.C.青霉素類藥物青霉素類藥物 D.D.高濃度食鹽高濃度食鹽B BC C（09，寧夏，寧夏，15分）分）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮）在大腸桿菌

20、培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮_、_和滲透壓等條件。由于該細菌具有體積小、結構簡單、變異類型容和滲透壓等條件。由于該細菌具有體積小、結構簡單、變異類型容易選擇、易選擇、_、_等優(yōu)點，因此常作為遺傳學研究的實驗材料。等優(yōu)點，因此常作為遺傳學研究的實驗材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行進行_（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進行清洗和（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進行清洗和_；靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質變性，還能靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能

21、使蛋白質變性，還能_。 （3）若用稀釋涂布平板法計數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計值）若用稀釋涂布平板法計數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計值更接近實際值，除應嚴格操作、多次重復外，還應保證待測樣品稀釋的更接近實際值，除應嚴格操作、多次重復外，還應保證待測樣品稀釋的_。 （4）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細菌進行初步的細菌進行初步的_。 （5）培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體）培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體培養(yǎng)基應采用的檢測方法是培養(yǎng)基應采用的檢

22、測方法是_。 （6）若用大腸桿菌進行實驗，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經過）若用大腸桿菌進行實驗，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經過_處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。答案答案:（1）溫度）溫度 酸堿度酸堿度 易培養(yǎng)易培養(yǎng) 生活周期短生活周期短 （2）滅菌）滅菌 消毒消毒 損傷損傷DNA的結構的結構 （3）比例合適）比例合適 （4）鑒定）鑒定(或分類或分類) （5）將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間）將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間,觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產生觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產生. （6）滅菌）滅菌例例3 3（20052005年江蘇）抗生素作為治療細菌感年江蘇）抗生素作為治療細菌感染的藥物，其高效性和巨大的經濟價值使抗生素工業(yè)染的藥物，其高效性和巨大的經濟價值使抗生素工業(yè)經久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應用具有劃時代的意經久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應用具有劃時代的意義。義。青霉素發(fā)酵產生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型青霉素發(fā)酵產生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是是 ，