細(xì)胞毒性試驗(yàn)方案

1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案1.胰酶 雙抗(青霉素/高DMEM(糖)鏈霉素)DAPI準(zhǔn)備材料：MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 指甲油 6 孔培養(yǎng)板 多聚甲醛 培養(yǎng)瓶(25mL) 96孔培養(yǎng)板 超 薄載玻片一包 0.45濾膜 m 以 滅菌： 50mL , 10mL , 5mL離心管兩種槍頭2.實(shí)驗(yàn)方案材料本實(shí)驗(yàn)所用的為載藥的通過(guò)二硫鍵橋連透明質(zhì)酸的 夾心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX ),在高谷胱甘肽條件下,二硫鍵斷 裂,透明質(zhì)酸脫離,同時(shí)SiO2-本實(shí)驗(yàn)的夾心二氧化硅中藥物得以釋放.目的為測(cè)定透明質(zhì)酸修飾的夾心二氧化硅(,SiO2-SS-HASiO2-SS-HA/DOXSS-H

2、A/DOX )的細(xì)胞毒性.實(shí)驗(yàn)組為、 DOX成纖維細(xì)胞為正常人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型和分別采用,HepG2 L929 空白對(duì)照組為純細(xì)胞細(xì)胞模型.SiO2-SS-HA/DOX 、 HepG2 人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型,實(shí)驗(yàn)組為采用1%w/v DOXSiO2-SS-HA 、,空白對(duì)照組為純細(xì)胞.10%v/v培養(yǎng)基中含有FBS和、.配制不同濃度的鏈霉素青霉素雙抗/ SiO2-SS-HA/DOXSiO2 HA 藥物載、DOX體培養(yǎng)基溶液.HepG2以人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型1.12% DMEM 87%1%血清培養(yǎng)基的配置：雙抗具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：C溫水中,使細(xì)胞快速溶解.將懸浮的細(xì)將凍存于液氮

3、中的細(xì)胞取由,迅速放入 37無(wú)血清培養(yǎng)基,5mL胞移至離心管中,力口 1000rmp,5min 離心每次轉(zhuǎn)移時(shí),將之前的離心管洗滌,5mL去上清,再加 有血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中.并用移液槍往返吸,使液體混合均勻.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞的傳代：C,每次使用一管,避的胰酶分裝至小離心管中,0.25% 將,凍存于2mL每個(gè)管中-20免反復(fù)凍融.的酒精放入超凈臺(tái).將培養(yǎng)液倒入廢液75%將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取由,蓋子旋緊,噴 缸,操作完成后,殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈,培養(yǎng)瓶口 -用火燒.參加2mL胰酶將瓶底鋪滿(mǎn),消化 2-3min ,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),呈2mL 12% DMEM 終止消化,

4、用槍吹打,使細(xì)胞懸浮.圓形,即消化完畢,參加離心.迅速倒掉上清,參加 10mL離心管中,1000rmp,5min,將細(xì)胞懸浮液移入 6mLDMEM 培養(yǎng)基,分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中,再各參加培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h.,于37 C, 5%的 CO22mLDMEM至5mL-.下一次傳代步驟同:細(xì)胞存活率測(cè)定方法(布板,加樣).同傳代步驟 -并用移液槍往返吸,使液體混合均勻,將所有含給每個(gè)離 心管中參加定量的培養(yǎng)基,有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL離心管中,最終使液體體積為30mL.個(gè)復(fù)孔,每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔,內(nèi)加培養(yǎng)液,不含 96孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì) 5細(xì)胞與藥物,一組空白對(duì)照組,只加培養(yǎng)基和細(xì)胞,不加藥

5、物.除過(guò)空白調(diào)零孔,每孔參加, 5% (v/v) CO 2 L 含細(xì) 胞的培養(yǎng)基.將孔板放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度, 100 2 22小時(shí).溫度保持在 37 C,培養(yǎng)微升的0.03g將谷胱甘肽參加到10mL培養(yǎng)基,充分溶解,濃度為 0.003g/mL, 取20.003g/mL 谷胱甘肽溶液參加到 10mL的培養(yǎng)基中,將這兩個(gè)濃度含谷胱甘肽的培養(yǎng)基替換局部原來(lái)的培養(yǎng)基,作為對(duì)照,不需要加谷胱甘肽的孔換上5% (v/v) CO 2 ,溫新鮮培養(yǎng)基,將孔板放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度,小時(shí),具體的加樣孔見(jiàn)圖一.2度保持在37 C,培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,分成兩份,其中 3mL樣品溶到SiO2-

6、SS-HA/DOX 1.2mg 將的的培養(yǎng)基,再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份,1.5mL一份里參加 其中一份SiO2-SS-HA/DOX 樣 新鮮培養(yǎng)基,依此類(lèi)推,便得到一個(gè)濃度梯度的參加 1.5mL品.SiO2-SS-HA 樣品的濃度配制方法同上.的0.918mg 將 SiO2-SS-HA/DOX的培養(yǎng)基中,剩下3mL.所示.將孔板放入培養(yǎng)箱孔板中的培養(yǎng)基,如圖 96 1將配制好的載體溶液替換原來(lái)37,溫度保持在C,培養(yǎng)5%(v/v) CO2 中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度,24小時(shí).5 mg/mL 配制的 溶液,將孔板中的培養(yǎng)更換成MTTMTT溶液,將孔板放-入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度

7、,5% (v/v) CO 2 ,溫度保持在37 C.培養(yǎng)4小時(shí)后,mm us: .和*工| kF Lp- iF .)1 A JK將孔板中的培養(yǎng)基取由,用PBS溶液清洗3次,然后向每孔參加100以L的DMSO ,溶解孔中的甲瓚,采用酶標(biāo)儀測(cè)定,波長(zhǎng)設(shè)定為 490nm圖1藥物載體布板示意圖.以L929成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞模型 實(shí)驗(yàn)組為 SiO2-SS-HA/DOX 、SiO2-SS-HA、 DOX ,空白對(duì)照組為純細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇y(cè)定藥物載體溶液對(duì)正常細(xì)胞 的細(xì)胞毒性.培養(yǎng)基的配置：雙抗 1%血清 12% DMEM 87%具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：C溫水中,使細(xì)胞快速溶解.將懸浮的細(xì)37將凍存于液

8、氮中的細(xì)胞取由,迅速放入離心胞移至離心管中,加5mL 無(wú)血清培養(yǎng)基, 1000rmp,5min每次轉(zhuǎn)移時(shí),將之前的離心管洗滌,去上清,再加 5mL有血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中.并用移液槍往返吸,使液體混合均勻.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞的傳代：C,每次使用一管,避 2mL ,凍存于-20將0.25%的胰酶分裝至小離心管中,每個(gè)管中 免反復(fù)凍融.的酒精放入超凈臺(tái).將培養(yǎng)液倒入廢液將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取由,蓋子旋緊,噴 75% 培養(yǎng)瓶口缸, 殘留培養(yǎng)基 用吸管吸干凈,操作完成后,用火燒.,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),呈圓形,即2-3min 2mL參加胰酶將瓶底鋪滿(mǎn),消化終止消化,用槍吹打,使細(xì)胞懸浮

9、.消化完畢,參加 2mL 12% DMEM離心.迅速倒掉上清,參加將細(xì)胞懸浮液移入10mL離心管中,1000rmp,5min,培養(yǎng)基,分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中,再各參加6mLDMEM.48h CO2 5% 37 5mL2mLDMEM ,至,于C,的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)下一次傳代步驟同-.細(xì)胞存活率測(cè)定方法布板,加樣 ：同傳代步驟-.并用移液槍往返吸,使液體混合均勻,將所有含給每個(gè)離 心管中參加定量的培養(yǎng)基,離心管中,最終使液體體積為50mL 12mL.有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)個(gè)復(fù)孔,每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔,內(nèi)加培養(yǎng)液,不含孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì) 5 96細(xì)胞與藥物,一組空白對(duì)照組,只加培養(yǎng)基和細(xì)胞,不加 藥物.

10、除過(guò)空白調(diào)零孔,每孔參加,以 100 5% (v/v) CO 2 L含細(xì)胞的培養(yǎng)基.將孔板放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度, 溫度保持在 37 22 C,培養(yǎng)小時(shí).- 將所有加樣的孔換成新鮮培養(yǎng)基,作為與癌細(xì)胞的對(duì)照.將孔板放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度,5%(v/v)CO2 ,溫度保持在 37 C,培養(yǎng) 2小時(shí).將0.4mg 的SiO2 -SS-HA/DOX 樣品溶到 1mL的培養(yǎng) 基中,分成兩份,其中一份里參加0.5mL的培養(yǎng)基,再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份,其中一份參加 0.5mL新鮮培養(yǎng)基,依此類(lèi)推,便得到一個(gè) 濃度梯度的 SiO2-SS-HA/DOX 樣品. SiO2-S

11、S-HA 樣品 的濃度配制方法同上.1mL的培養(yǎng)基中,剩下的步驟同 0.306mg 的SiO2-SS-HA/DOX 樣品溶到將.o,所示.將孔板放入培養(yǎng)箱將配制好的載體溶液替換原來(lái)96孔板中的培養(yǎng)基,如圖 2,溫度保持在 37 C,培養(yǎng)中,培養(yǎng)箱保持一定的濕度,5%(v/v) CO2小時(shí).24溶液,將孔板放入培養(yǎng)箱中,MTT配制5 mg/mL 的溶液,將孔板中的培養(yǎng)更換成MTT小時(shí)后,將孔板中的培培養(yǎng)箱保持一定的濕度,5% (v/v) CO 2,溫度保持在 37 Co培養(yǎng)4,溶解孔中的甲瓚,采DMSO以L的3養(yǎng)基取由,用PBS溶液清洗次,然后向每孔參加100490nm用酶標(biāo)儀測(cè)定,波長(zhǎng)設(shè)定為二(ODtreated -ODblank /OD control -:細(xì)胞存活率細(xì)胞存活