血清蛋白的聚丙烯酰胺電泳

1、學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)( (一一) ) 帶電的膠粒或大分子在外加電場中，向帶相反電荷帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋校驇喾措姾傻碾姌O作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。的電極作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。 1. 分離各種有機物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等分離各種有機物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等 2. 分析某種物質(zhì)的純度及分子量分析某種物質(zhì)的純度及分子量 3.電泳技術(shù)與層析法結(jié)合可用于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析電泳技術(shù)與層析法結(jié)合可用于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析 4.免疫電泳可提高對蛋白質(zhì)的鑒別能力免疫電泳可提高對蛋白質(zhì)的鑒別能力 待分

2、離大分子的性質(zhì)待分離大分子的性質(zhì) ：所帶的電荷、分子大小和形狀。：所帶的電荷、分子大小和形狀。 分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。其電泳遷移速度越快。 電場強度：過高，產(chǎn)熱，蛋白變性導(dǎo)致不能分離；電場強度：過高，產(chǎn)熱，蛋白變性導(dǎo)致不能分離； 緩沖緩沖液水分蒸發(fā)過多，離子強度增加；過低，電泳時間增加，液水分蒸發(fā)過多，離子強度增加；過低，電泳時間增加，擴散。當(dāng)需要增大電場強度以縮短電泳時間時，需附有擴散。當(dāng)需要增大電場強度以縮短電泳時間時，需附有冷卻裝置。冷卻裝置。 電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動；當(dāng)電滲電

3、滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度，反之，方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度當(dāng)兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度。電泳的影響因素電泳的影響因素 支持介質(zhì)的篩孔支持介質(zhì)的篩孔 ：篩孔越小，則顆粒在移動的：篩孔越小，則顆粒在移動的過程中所受到的阻力也就越大。過程中所受到的阻力也就越大。 緩沖液緩沖液pH和離子強度：和離子強度：pH值距離其等電點愈遠(yuǎn)，值距離其等電點愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大 ；但是但是pH過高或過低引起蛋白變性；緩沖液通常

4、過高或過低引起蛋白變性；緩沖液通常要保持一定的離子強度，強度過低，則緩沖能力要保持一定的離子強度，強度過低，則緩沖能力差，不易維持差，不易維持pH恒定，離子強度過高，在待分恒定，離子強度過高，在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強度為速度減慢。一般所用離子強度為0.020.2之間。之間。( (二二) ) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 以聚丙烯酰胺凝膠作支持介質(zhì)的一種電泳方法以聚丙烯酰胺凝膠作支持介質(zhì)的一種電泳方法, ,由由丙烯酰

5、胺丙烯酰胺( (Acr) )單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺( (Bis) )在在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。當(dāng)當(dāng)Acr和和Bis遇到自由基時，便能聚合。引發(fā)自由基產(chǎn)遇到自由基時，便能聚合。引發(fā)自由基產(chǎn)生的方法有兩種：化學(xué)法和光化學(xué)法生的方法有兩種：化學(xué)法和光化學(xué)法. .1.凝膠聚合催化體系凝膠聚合催化體系 化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸胺（簡稱化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸胺（簡稱AP）。在。在催化劑催化劑N，N，N，N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺 （簡稱簡稱TEMED）的作用下，由的作用下，由AP形成氧自由基而引發(fā)聚合反

6、應(yīng)，形成氧自由基而引發(fā)聚合反應(yīng)，由于反應(yīng)需要由于反應(yīng)需要TEMED的游離堿基，所以在低的游離堿基，所以在低pH下，下，聚合反應(yīng)可能延遲甚至被阻止。增加聚合反應(yīng)可能延遲甚至被阻止。增加TEMED或過或過硫酸銨濃度可以增加聚合反應(yīng)速度，但速度過快硫酸銨濃度可以增加聚合反應(yīng)速度，但速度過快影響制板操作，兩者濃度過高也影響蛋白質(zhì)活性。影響制板操作，兩者濃度過高也影響蛋白質(zhì)活性。 （1）光催化：核黃素光催化：核黃素 （2）化學(xué)催化：化學(xué)催化：AP-TEMED 催化體系催化體系 TEMED（四甲基乙二胺四甲基乙二胺）催化催化AP（過硫酸胺過硫酸胺）生成硫酸自由基生成硫酸自由基：S2O82 2SO4 硫酸自

7、由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長鏈：單體并形成單體長鏈：Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)： 化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響：重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響： 催化劑和加速劑的濃度催化劑和加速劑的濃度 pH 堿性條件堿性條件 溫度溫度 分子氧分子氧 雜質(zhì)雜質(zhì) 分子量范圍分子量范圍 適用的凝膠濃度適用的凝膠濃度/ /( (%) ) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5蛋白分子

8、量范圍與凝膠濃度的關(guān)系蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系2. 凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān) 3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1) 在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2) 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，很多溶劑中化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，很多溶劑中 不溶；不溶；(3) 對對pH和溫度變化較穩(wěn)定；和溫度變化較穩(wěn)定；(4) 幾乎無吸附和電滲作用，只要幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，純度高，操作條件一致， 則樣品分離重復(fù)性好；則樣品分離

9、重復(fù)性好；(5) 樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達(dá)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g；(6) 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃 度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7) 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩 和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖 電泳等有更高的分辨率。電泳等有更高的分辨率。4.聚丙烯酰胺凝膠種類聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系

10、統(tǒng)與連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)兩大類兩大類 不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng): :是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)

11、越性，分辨率高。但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。 (2)常用的多為圓盤電泳和板狀電泳，原理完全相同常用的多為圓盤電泳和板狀電泳，原理完全相同。 (3)不連續(xù)體系不連續(xù)體系: :電極緩沖液、濃縮膠及分離膠電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為液為pH 6.7的的Tris-HC1。分離膠是由分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為液為pH 8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是電極緩沖液是pH 8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。甘氨酸緩沖液。 1) 樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)

12、 A. 凝膠孔徑不連續(xù)性凝膠孔徑不連續(xù)性 B. 緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 C. 電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 2) 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 3) 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)(4) 不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用三三. . 實驗器材實驗器材1 1、電泳儀、電泳儀, ,電泳槽及其附件電泳槽及其附件2 2、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿3 3、脫色搖床、脫色搖床4 4、燒杯、燒杯5 5、移液槍、移液槍6 6、吸量管、吸量管7 7、槍頭等、槍頭等四四. . 實驗試劑實驗試劑 ( (參考參考P121)P121)1.1. 人血清；人血清；2.2. 分離膠緩

13、沖液：分離膠緩沖液：Tris-HClTris-HCl緩沖液緩沖液 PH8.9PH8.9；3.3. 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液: Tris-HCl: Tris-HCl緩沖液緩沖液 PH6.7PH6.7；4.4. 分離膠貯液分離膠貯液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,:Acr 28.0g,Bis 0.735g,無離子水溶解定容至無離子水溶解定容至100ml100ml； 5.5. 濃縮膠貯液濃縮膠貯液: Acr10.0g,Bis2.5g,: Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至無離子水溶解定容至100ml100ml；6.6. 1.6% 1.6% 過硫酸銨溶液過硫酸銨溶液: 1

14、.6g : 1.6g 過硫酸銨溶于過硫酸銨溶于100ml 100ml 無離子水中；無離子水中； 7.7. 電泳緩沖液電泳緩沖液: Tris-: Tris-甘氨酸緩沖液甘氨酸緩沖液PH8.3,PH8.3,用時稀釋用時稀釋1010倍；倍；8.8. 1% 1% 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250G-250；6% 6% 乙酸溶液；乙酸溶液；40% 40% 蔗糖溶液；蔗糖溶液； 0.1% 0.1% 溴酚藍(lán)溶液溴酚藍(lán)溶液 ( (一一) ) 垂直平板電泳槽的安裝垂直平板電泳槽的安裝( (二二) ) 凝膠的制備凝膠的制備( (三三) ) 加樣加樣( (四四) ) 電泳電泳( (五五) ) 固定和染色固定和染色(

15、(六六) ) 脫色脫色五五. . 操作步驟操作步驟 ( (一一). ). 垂直平板電泳槽的安裝垂直平板電泳槽的安裝 ( (二二). ). 凝膠的制備凝膠的制備名稱名稱分離膠緩沖液分離膠緩沖液分離膠貯液分離膠貯液 1.6%1.6%過硫酸胺（過硫酸胺（APAP） 無離子水無離子水體積比例體積比例1 1（2 2號）號）2 2（4 4號）號）1 1（6 6號）號）4 4取量取量 mLmL1 12 21 14 41.1. 分離膠的制備分離膠的制備 (7%) (7%) 配配8mL8mL迅速混勻迅速混勻 取取6mL6mL沿壁加樣沿壁加樣, ,基本上加到基本上加到2/32/3處處, ,再取大約再取大約3 3

16、mLmL水加在上面補滿覆蓋水加在上面補滿覆蓋室溫靜置室溫靜置30 min 30 min ( (烘箱烘箱3737度度, ,凝聚速度快凝聚速度快) )名稱名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液濃縮膠貯液濃縮膠貯液1.6% 1.6% 過硫酸胺過硫酸胺（APAP）40% 40% 蔗糖蔗糖體積比例體積比例1 1（3 3號）號）2 2（5 5號）號）1 1（6 6號）號）4(94(9號）號）取量取量 mLmL0.50.51 10.50.52 22.2.濃縮膠的制備濃縮膠的制備 (2.5%) (2.5%) 配配 4 4 mLmL迅速混勻迅速混勻, , 取取3 3 mLmL沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到

17、分離膠上面, ,直至離邊直至離邊緣緣5mm5mm處處, , 迅速插入加樣梳迅速插入加樣梳, , 室溫或室溫或3737度烘箱靜置一段時間度烘箱靜置一段時間. .加樣梳需一次平穩(wěn)插入加樣梳需一次平穩(wěn)插入, ,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡, ,梳底需水平梳底需水平. .凝聚后倒出上層的水凝聚后倒出上層的水, ,用小濾紙條吸去表面水分用小濾紙條吸去表面水分凝膠凝聚后，垂直拔出加樣梳，用窄條濾紙吸去樣凝膠凝聚后，垂直拔出加樣梳，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體。品凹槽中多余的液體。( (三三). ). 進進 樣樣將凝膠板放在電泳槽內(nèi)，將凝膠板放在電泳槽內(nèi)， 加入稀釋加入稀釋1010倍的倍的Tris

18、Tris甘甘氨酸電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約氨酸電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm,0.5cm,即即可加樣可加樣要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出, ,否則會影否則會影響加樣效果響加樣效果. .注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。取血清樣品取血清樣品0.1ml,40%0.1ml,40%蔗糖溶液蔗糖溶液0.2ml,0.05%0.2ml,0.05%溴酚藍(lán)溶溴酚藍(lán)溶液液0.05ml0.05ml混合后，用微量注射器取上述混合液，通過混合后，用微量注射器取上述混合液，通過緩沖液，距凝膠凹形樣品槽底三分之一處進樣緩沖液，距凝膠凹形樣品槽底三分之一處

19、進樣, , 待所待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。 每個同學(xué)可做梯度上樣每個同學(xué)可做梯度上樣, , 10l10l注射器不可過低注射器不可過低, ,以防刺破膠體以防刺破膠體, ,也不可過高也不可過高, ,否則在否則在樣品下沉?xí)r會發(fā)生擴散樣品下沉?xí)r會發(fā)生擴散. .( (四四). ). 電電 泳泳 將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（方向切勿接錯方向切勿接錯）將電泳緩沖液倒入電泳外槽，打開電泳儀開關(guān)，開始時將電泳緩沖液倒入電泳外槽，打開電泳儀開關(guān)，開始時將電壓調(diào)至將電壓調(diào)至150150200V200V，待樣品進入分離膠時，將電壓，待樣品進入分離膠時，將電壓調(diào)至調(diào)