DNA電泳常見問題分析

1、DNA電泳常見問題分析DNA電泳常見問題凝膠電泳操作注意事項(xiàng)1、瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜 質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有 選擇地使用。2 、 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相 一致，溶化的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié) 塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié) 果。3 、 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強(qiáng)度和 pH,應(yīng) 經(jīng)常更新電泳緩沖液。4 、 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5卜g的DNAS,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及 DNA 中片段的數(shù)量和大小而定.當(dāng)加樣孔大時(shí)，樣品上樣量應(yīng) 相應(yīng)加大，否則會(huì)造成條帶淺

2、甚至辨認(rèn)不清；反之則應(yīng)適 當(dāng)減少加樣量，但是上樣量過多會(huì)造成加樣孔超載，從 而導(dǎo)致拖尾或彌散，對(duì)于較大的 DNAt匕現(xiàn)象更明顯。5 、DNA羊品中鹽濃度會(huì)影響DNA勺遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。6 、DNAf移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辯范圍廣泛 的DN后子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù) DNg子的范圍來 決定凝膠的濃度。小片段DNA的檢測(cè)應(yīng)采用聚丙烯酰胺 凝膠電泳，以提高分辨率。7 .選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長。8 .在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減 少DNAU塊形成。9 .提取的DN環(huán)易溶解：不純

3、，含雜質(zhì)較多；加溶解液 太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困 難。10 .電泳檢測(cè)時(shí)DNA涂布狀：操作不慎；污染核酸酶 等。11 .分光光度分析 DNA勺A280/A260小于1.8;不純，含 有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入 SDS至終濃度 為0.5%,并重復(fù)步驟28。12 .酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含 高濃度的DNA可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織 的量DNA電泳常見問題分析之一1請(qǐng)問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時(shí)，促凝的是 TEMED還是過硫酸鏤？膠聚時(shí)間很長如何解決？過硫酸鏤提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需 的自由基，而TEMED通過催化過硫酸

4、鏤形成自由基而 加速它倆的聚合。膠聚合時(shí)間長可能是TEMED失效了， 過硫酸鏤固體時(shí)間過久也會(huì)失效的。一個(gè)讓PAGE膠很快聚合的方法：不要先配AP （過硫酸鏤）溶液，因?yàn)?AP很容易變質(zhì)。 在保證TEMED和AP質(zhì)量的情況下，每次配膠時(shí)，直 接稱一定量的AP粉劑溶入液體狀態(tài)的PAGE中，這樣 可以保證AP的催化能力，而且可以多加一點(diǎn)。配 25ml 的PAGE膠，加0.03克AP粉齊J,最后加入25U1TEMED , 20分鐘左右就可以凝固（當(dāng)然這個(gè)時(shí)候拔梳子，會(huì)有少 量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看 起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和 位置）。2 DNA電泳的M

5、ARKER 怎么是扭曲的？1、配制膠時(shí)的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時(shí)配制 的.最好是同時(shí)配制.電泳時(shí)緩沖液高過液面12mm即 可。2、電泳時(shí)電壓過高，可以在電泳前15分鐘用較低電壓 （3V/cm）,等條帶出孔后比較漂亮了 .然后再調(diào)電壓。3、上樣時(shí)盡量慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。3跑出的DNA帶模糊？1、DNA降解：避免核酸酶污染。2、電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。 建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、所用電泳條件不合適：電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm , 溫度V30C；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)V 15 C；核查 所用電泳緩沖

6、液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA上樣量過多：減少凝膠中 DNA上樣量。5、DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的 鹽。6、有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA變性：電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液 稀釋DNA。4有不規(guī)則DNA帶遷移？1、對(duì)于人/Hind III片段cos位點(diǎn)復(fù)性：電泳前于 65 C 加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。2、電泳條件不合適：電泳電壓不超過 20V/cm ;溫度 <30C;經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 DNA 變性：以 20mM NaCl Buffer 稀釋 DNA ,電 泳前勿加熱。5跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶？1、DN

7、A的上樣量不夠：增加 DNA的上樣量；聚丙烯 酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng) 降低。2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、 DNA走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、對(duì)于EB染色的DNA ,所用光源不合適？應(yīng)用短波 長（254nm ）的紫外光源。6跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事？1、如果是小DNA帶走出凝膠，可以縮短電泳時(shí)間或降 低電壓或增強(qiáng)凝膠濃度。2、分子大小相近的DNA帶不易分辨？增加電泳時(shí)間， 核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。3、DNA 變性：電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA鏈，以20mM NaCl Buffer 稀釋 DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適

8、？在脈沖凝膠電 泳上分析。7做PCR電泳后跑電泳，目的基因是 489BP的， 結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成 500多了，快到600 了？為什么？有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示目的片段是 1300多, 結(jié)果就跑到1000的marker下面去了，后來證實(shí)片段沒 有問題。也有做的一個(gè)片段也是這樣，是490BP.理論上 兩個(gè)條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯示就是大小不一致。然 后回收以后的檢測(cè)結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做 了下一個(gè)測(cè)序，才知道根本沒有問題。8:為什么marker條帶非常模糊，無法辨別具體條 帶？A:出現(xiàn)上述情況，可能有以下幾個(gè)原因：1. m

9、arker條帶出現(xiàn)了降解。請(qǐng)確保在使用過程中避 免核酸酶污染；2.電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使 用后，離子濃度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而 影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；3.電泳條件 不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過20V/cm,溫度應(yīng)低于30C; 4. marker上樣量過多。請(qǐng)根據(jù)說明書選用合適上樣量； 5.凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；止匕外, 凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。9:為什么marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則的條帶（如啞鈴 狀等）？A:出現(xiàn)上述情況，多與以下幾個(gè)原因有關(guān)：1.電泳緩 沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低，pH值上升, 緩沖能力減弱，從而影響電

10、泳效果，建議經(jīng)常更換電泳 緩沖液；2.電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過 20V/cm,電壓太高可能也會(huì)導(dǎo)致marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則 現(xiàn)象。止匕外，凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時(shí)凝固不均勻也 會(huì)導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)。10為什么marker條帶非常弱或者根本沒有條帶？A:出現(xiàn)上述情況可能是：1. marker上樣量較低，可適 當(dāng)增加上樣量；2.凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會(huì) 導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒有條帶；3.電泳時(shí)間過長導(dǎo)致 marker條帶跑出凝膠，可縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增 加凝膠濃度。11:為什么 marker缺帶？A:對(duì)于含有較小片段的 marker,如果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象， 可能是因?yàn)椋?.小條帶

11、跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶 不易辨認(rèn)所致，可適當(dāng)縮短電泳時(shí)間，降低電壓，同時(shí) 增加凝膠濃度；2.凝膠中EB含量過低，導(dǎo)致大片段結(jié) 合EB量太少或沒有，在紫外光下亮度太低， 可適當(dāng)增加 EB用量。原因解決辦法DNA降避免核酸酶污染解電泳緩電泳緩沖液多次使用后，離沖液陳舊子強(qiáng)度降低，pH值上升，4爰沖能力減弱，從而影響電泳效果O問DNA 帶模糊所用電 泳條件不合 適DNA上樣量過多DNA樣含鹽過高有蛋白 污染DNA變性規(guī)DNA遷移入 /Hind 段cos 復(fù)性于III片位點(diǎn)電泳條 件不合適建議經(jīng)常更換電泳緩沖液電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度V 30 C；巨大 DNA 鏈電泳，溫度應(yīng)v

12、 15 C；核查所用電 泳緩沖液是否有足夠的緩沖能 力減少凝膠中DNA上樣量電泳前通過乙醇沉淀去除 過多的鹽電泳前酚抽提去除蛋白電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA電泳前于65 c力口熱DNA 5 分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘電泳電壓不超過20V/cm ; 溫度V 30 c ;經(jīng)常更換電泳緩沖 液DNA變性DNA的 上樣量不夠以 20mM NaCl Buffer 稀釋DNA ,電泳前勿加熱增加DNA的上樣量；聚丙 烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng) 降低帶 弱或無DNA帶DNA 帶缺失DNA降 解DNA走 出凝膠對(duì)于EB 染色的DNA , 所用光源不 合適小DNA 帶

13、走出凝膠分子大 小相近的 DNA帶不易 分辨DNA變 性避免DNA的核酸酶污染縮短電泳時(shí)間，降低電壓, 增強(qiáng)凝膠濃度應(yīng)用短波長（254nm ）的紫 外光源縮短電泳時(shí)間，降低電壓, 增強(qiáng)凝膠濃度增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的 凝膠濃度電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA鏈，以 20mM NaCl Buffer 稀釋DNADNA鏈巨大常規(guī)凝膠電泳不合適在脈沖凝膠電泳上分析題問可能原因解決方法DNA Marker 降解核酸酶污染每次吸取時(shí)更插 滅菌槍頭，勿將電泳緩 沖液帶入管中；用后密 閉4°C保存保存不當(dāng)4 C 或-20 °C 傷存，避免多次反復(fù)凍 融；不可加熱DNA Marker 無法正 確

14、分離瓊脂糖質(zhì)量 差使用質(zhì)量可靠, 瓊脂糖制膠J電泳緩沖液 多次使用后失效更換緩沖液條 帶黯淡核酸濃度過 低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶 的試劑和耗材制備樣品DNA條帶被 示蹤染料掩蓋提高上樣量；避免 使用與目的片段遷移率相同的示蹤染料條帶模糊 或彌散電泳緩沖液 多次使用后失效更換緩沖液核酸部分降 解使用不含核酸酶 的試劑和耗材制備樣 品1核酸樣品純 度差，含有 DNA 結(jié)合蛋白或高濃 度的鹽份酚/仿抽提或乙醇 沉淀去除蛋白、鹽份等 雜質(zhì)電壓過低，電 泳時(shí)間過長根據(jù)凝膠大小和 電泳緩沖液類型，使用 適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳染色時(shí)間過 長或拍照前放置 過久，DNA條帶彌 散電泳結(jié)束后及M 觀察、拍照

15、I-條 帶缺失DNA條帶分子量過大使用脈沖凝膠電 泳分子量接近 的DNA條帶沒有 分開電泳緩沖液 使用不當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)哪z 濃度進(jìn)行電泳條 帶大小 不正確電泳時(shí)間過 長或電壓過高， DNA走出凝膠電極插反，DNA走出凝膠核酸降解或 形成聚合物入DNA酶切 Marker 的 cos 位 點(diǎn)復(fù)性相同分子量 的DNA片段由于 結(jié)構(gòu)或序列的差SD和TBE緩沖液 適于分析較小分子量 的DNA片段，大片段 分子不能完全分離； TAE緩沖液不適于分 離很小的DNA片段縮短電泳時(shí)間，調(diào) 整電壓正確連接電極方 向加熱處理或重新 制備樣品電泳前65° C加熱 5分鐘，冰上冷卻5分 鐘以后再上樣判斷DNA分子是 否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺 口、超螺旋、二聚體等；異而有不同的遷富含AT堿基的DNA移率遷移率比同分子量富含GC堿基的DNA片段慢梳子變形，點(diǎn) 使用完好的梳子樣孔不在同一水制膠平線上帶 型異常不同樣本的 上樣條件不同上樣量過大選用相同的上樣 緩沖液，上樣量