生物制藥工藝學(xué)抗生素概述講義

1、第一節(jié)：抗生素概述 教學(xué)目標(biāo)：了解青霉素等抗生素的生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)和提取精制方法；掌握溶劑萃取法提取青霉素的原理。教學(xué)基本內(nèi)容：§ 1 概述1.1 B -內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)構(gòu)和特性B -內(nèi)酰胺類抗生素(B -lactam)包括青霉素(penicillins) 、頭抱菌素 (cephalosporin) 、頭霉素(cephamycin) 、克拉維酸(clavulanic acid) 、塞納霉素(thienamycin)以及單環(huán)B -內(nèi)酰胺等。這類抗生素都含有一個(gè) 4員內(nèi)酰胺 環(huán)，并且通過(guò)N 和相鄰的碳原子和另一個(gè)雜環(huán)相稠合。它們結(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)是：和內(nèi)酰胺中N相鄰的碳原子上有

2、一個(gè)竣基；在內(nèi)酰胺環(huán)中和N原子相對(duì)的C原子上有一個(gè)功能團(tuán)胺基。青霉素可看成是由B -內(nèi)酰胺環(huán)、四氫嚷吵環(huán)及酰基側(cè)鏈構(gòu)成；也可看成是 由半胱氨酸、緞氨酸及側(cè)鏈構(gòu)成；而頭抱菌素則是有由B -內(nèi)酰胺環(huán)與六元的氫 化噻嗪環(huán)駢合而成；或由半胱氨酸、纈氨酸、側(cè)鏈和醋酸構(gòu)成。1.2 化學(xué)性質(zhì)B-內(nèi)酰胺類抗生素通常很活潑，它的化學(xué)性質(zhì)大都和B -內(nèi)酰胺環(huán)有關(guān)，由 于為稠環(huán)系統(tǒng)，故環(huán)的應(yīng)力增加，因而反應(yīng)性更強(qiáng)。在很多情況下，內(nèi)酰胺環(huán)中羰基的反應(yīng)性能和羧酸苷相似，很易被親核試劑和親電試劑作用，使內(nèi)酰胺環(huán) 打開而失去活性。與青霉素相比，頭抱菌素較不易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，如醇能很快和青霉素的B內(nèi)酰胺環(huán)起作用，但頭孢菌素較穩(wěn)

3、定，故可以把甲醇作為重結(jié)晶的溶劑。頭孢 菌素對(duì)酸也較穩(wěn)定。§ 2 青霉素2.1 天然存在的青霉素青霉素的基本結(jié)構(gòu)是由B -內(nèi)酰胺環(huán)和曝口坐烷環(huán)并聯(lián)組成的N - 6 -氨基青 霉烷酸。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中不加側(cè)鏈前體時(shí)， 產(chǎn)生多種N-酰基取代的青霉素混合 物，見上表，但其中只有青霉素G和青霉素V在臨床上有用。它們具有相同的抗菌譜(抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)，其中青霉素G對(duì)酸不穩(wěn)定， 只能非腸道給藥吸收，而青霉素V對(duì)酸穩(wěn)定，可以口服給藥。發(fā)酵中也產(chǎn)生青霉素母核6-氨基青霉烷酸(6-APA) ，但產(chǎn)量很低。工業(yè)上是用固定化青霉素?；杆馇嗝顾谿或V制備6-APA,再由化學(xué)法或酶法進(jìn)行側(cè)鏈縮合，獲得一系

4、列半合成青霉素。2.2 青霉素的理化性質(zhì)溶解度：青霉素G是一種游離酸，能與堿金屬，堿土金屬，有機(jī)胺等結(jié)合成鹽。青霉素本身容易溶于有機(jī)溶劑，如醇，酮，醚，酯。在水中溶解度很小，但 成鹽后在水，甲醇中的溶解度大，而在脂性的有機(jī)溶劑中則不溶或難溶。吸濕性： 青霉素鈉鹽的吸濕性極強(qiáng)，銨鹽次之，鉀鹽的吸濕性較小并更易保存。 青霉素的純度越高，吸濕性反而減少，也就易于存放，所以晶體吸濕性小，而無(wú)定型粉末吸濕性就大。穩(wěn)定性： 青霉素的水溶液很不穩(wěn)定，一般都是固體保存，在臨用前才用水溶解。 一般青霉素越純，越干燥， 穩(wěn)定性越強(qiáng)。青霉素成品中含有水分或純度低，則穩(wěn)定性大為降低。酸堿性： 青霉素分子中有一個(gè)羧基，

5、故有酸性，因無(wú)堿性基團(tuán)，不存在堿性。青霉素的酸性在有機(jī)物中是較強(qiáng)的，但比無(wú)機(jī)酸弱，提取時(shí)，用酸將水溶液的pH調(diào)至2,就可以游離出青霉烷酸，而可用有機(jī)溶劑提取。2.3 青霉素的主要化學(xué)反應(yīng)青霉素是不穩(wěn)定的化合物，在遇酸， 堿或加熱下易分解而失去活性。青霉素的抗菌作用是以B -內(nèi)酰胺環(huán)的完整性為基礎(chǔ)的，而青霉素最易遭破壞的也是B -內(nèi)酰胺環(huán)，所以，凡能使B -內(nèi)酰胺環(huán)開裂的酸堿，酶，均可以使青霉素失去活 性。青霉素酶（B-內(nèi)酰胺酶）能使B -內(nèi)酰胺環(huán)開裂。青霉素的裂解青霉素在青霉素酰胺酶的作用下，能裂解為6-氨基青霉烷酸。該化合物既是青霉素的母核，又是半合成青霉素的原料。反應(yīng)式為：綜上所述，青霉素

6、在酶、堿、 酸性存在下，不同的條件水解可以得到不同的產(chǎn)物。絕大多數(shù)條件下都會(huì)使青霉素的B -內(nèi)酰胺環(huán)開裂，使青霉素失去其抗菌 活性。只有用青霉素酰胺酶裂解，方可保住其抗菌活性。2.4 青霉素的發(fā)酵工藝及過(guò)程2.4.1 菌株的改良與保存2.4.2 發(fā)酵工藝流程以絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程為例；此外還有球狀菌二級(jí)發(fā)酵工藝流程。其工藝流程基本相似。2.4.3 發(fā)酵工藝過(guò)程及操作要點(diǎn)種子絲狀菌的生產(chǎn)菌種一般保藏在沙土管內(nèi)。由沙土孢子接入母瓶斜面上，經(jīng) 25培養(yǎng) 67 天，長(zhǎng)成綠色孢子，制成懸液，接入大米茄子瓶?jī)?nèi)。經(jīng)25相對(duì)濕度50%，培養(yǎng)67 天，制成大米孢子，真空干燥保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時(shí)按接種量移入種子罐，

7、25培養(yǎng)4045 小時(shí)，菌絲濃度達(dá)40%以上，菌絲形態(tài)正常，即移入繁殖罐內(nèi)。經(jīng) 25c培養(yǎng)1315h,菌絲體積占總體積40% 以上，培養(yǎng)液中的殘?zhí)窃?.0%左右，無(wú)菌檢查合格便可作為種子，按30%的接種量移入發(fā)酵罐。優(yōu)質(zhì)種子應(yīng)該是：菌絲長(zhǎng)稠，菌絲團(tuán)很少，菌絲粗壯，有中小空胞，無(wú)雜菌。要獲得優(yōu)質(zhì)種子，就必須嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件及培養(yǎng)原材料的質(zhì)量。培養(yǎng)基碳源碳源 青霉菌能利用多種碳源，如乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，玉米油，豆油，天然油脂等。乳糖能被產(chǎn)生菌緩慢的利用而成為維持青霉素分泌的有利條件，故為最佳碳源，但因貨源少，價(jià)格高，普遍使用有困難。天然油脂如玉米油、豆油也能被緩慢利用而作為有效的碳源，但不可

8、能大規(guī)模使用。目前生產(chǎn)上用的碳源是葡萄糖母液和工業(yè)用葡萄糖，最為經(jīng)濟(jì)合理。培養(yǎng)基氮源氮源 青霉素工業(yè)發(fā)酵中，利用的氮源有玉米漿，花生餅粉、麩皮粉、 玉米胚芽粉及尿素等。玉米漿是淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，含有多種氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸以及B -苯乙胺等，后者為葦青霉素生物合成提供側(cè)鏈的前體。但因?yàn)閲?guó)內(nèi)玉米漿產(chǎn)量少，經(jīng)調(diào)整配方以花生餅粉代替，其生產(chǎn)水平可以達(dá)到用玉米漿的技術(shù)指標(biāo)。目前生產(chǎn)上用的氮源是花生餅粉、麩皮粉、玉米胚芽粉及尿素等。培養(yǎng)基前體青霉素發(fā)酵所用的前體有苯乙酸和苯乙酰胺等。前體大部分會(huì)參與青霉素的生物合成，構(gòu)成青霉素分子結(jié)構(gòu)，也有一部分會(huì)被青霉素當(dāng)成碳源和能源利用

9、分解。苯乙酸和苯乙酰胺在不同濃度和不同的酸堿度下，對(duì)青霉菌產(chǎn)生的毒性，以苯乙酰胺的毒性為大。苯乙酰胺和苯乙酸濃度大于0.1%時(shí)，對(duì)青霉素的生長(zhǎng)、繁殖和青霉素的生物合成均有毒性。培養(yǎng)液的pH 值不同，前體毒性也不同。苯乙酸在pH5.5 時(shí)，毒性較大，堿性條件下不抑制菌絲生長(zhǎng)；苯乙酰胺毒性比苯乙酸毒性大。前體在基礎(chǔ)料中，一般加入0.07%的量，其余部分一般在補(bǔ)料中，同碳源、氮源一起加入，前體的濃度一般為0.1%。近年來(lái)，也有利用苯乙酰酯類，醇類作為前體的，如用苯乙酸月桂酯，既可以作為前體，又能作為碳源被利用，還能作為消沫劑使用，用量為1.251.5%。加入硫代硫酸鈉能減少它們的毒性。培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽發(fā)

10、酵液中，無(wú)機(jī)離子的種類和濃度對(duì)于青霉素菌的生長(zhǎng)和生物合成均有影響：a. 硫的濃度降低時(shí)，青霉素的產(chǎn)量減少至30%；b. 磷的濃度降低時(shí)，青霉素的產(chǎn)量減少50%；c.鐵離子的濃度在6g/mL時(shí)，對(duì)發(fā)酵無(wú)影響。如果超過(guò) 30-40 g/mL,對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，且濃度越大，產(chǎn)量越低；d.鈣、鎂、鉀等陽(yáng)離子總濃度在 300mmol/L為好，其中的比例為鉀30%鈣 20%，鎂41%，此時(shí)青霉素的產(chǎn)量最高。（ 3）培養(yǎng)條件的控制青霉菌細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生明顯的變化，按生長(zhǎng)的特征分為6 個(gè)時(shí)期：I期 分生抱子發(fā)芽抱子先膨脹，再形成小的芽管，原生質(zhì)未分化，具有小空孢。r期 菌絲繁殖原生質(zhì)的嗜堿性很強(qiáng)

11、，在R期末有類脂肪小顆粒。田期 形成脂肪包涵體積累貯藏物，沒有空泡，原生質(zhì)嗜堿性仍很強(qiáng)。IV期 脂肪包涵體形成小滴并減少形成中小空泡，原生質(zhì)嗜堿性弱，并產(chǎn)生抗生素。V期形成大空泡其中含有一個(gè)或數(shù)個(gè)中性紅染色的大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。VI期 菌絲完全自溶僅有空的細(xì)胞壁。一般說(shuō)來(lái)，I IV期稱初稱菌絲生長(zhǎng)期，年輕的菌絲，以菌絲生長(zhǎng)、繁殖為主， 不合成青霉素或合成青霉素較少；IV V期稱青霉素分泌期，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)趨勢(shì) 漸減弱，合成青霉素的能力最強(qiáng)。VI期即菌絲自溶期，菌體開始自溶。在發(fā)酵過(guò)程中，要求盡量縮短菌絲的生長(zhǎng)繁殖時(shí)間，延長(zhǎng)青霉素的生物合成、分泌時(shí)間，通過(guò)工藝條件的

12、控制，使最后一期盡量晚出現(xiàn)，提高青霉素的發(fā)酵單位和總產(chǎn)量。加糖控制絲狀菌的加糖依據(jù)是發(fā)酵液中殘?zhí)橇亢蚿H值。一般殘?zhí)菨舛冉档椭?.6%左右，pH上升后可開始補(bǔ)糖。加糖率為 0.07%0.15%/h,每2h加1次。球狀菌加糖主要依據(jù)是pH， 一般在 20h 當(dāng) pH 高于6.5 時(shí)開始加糖，全程 pH要求6.77.0 o根據(jù)pH高低酌情減增，放罐要求pH低于7.0。若改變加糖方 式， 以葡萄糖流加代替每2h 的滴加， 則可減少總的加糖量，還可提高發(fā)酵單位。補(bǔ)料及添加前體絲狀菌發(fā)酵于接種后812h， 發(fā)酵液中殘余苯乙酰胺濃度為0.05 0.08。若pH大于6.5可隨時(shí)加入硫酸錢，使pH維持在6.2

13、6.4 ,發(fā)酵液氨氮控制在 0.010.05 。球狀菌發(fā)酵因基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)沒有前體，所以從 10h 左右就開始加入尿素、氨水和苯乙酸的混合料，每3h 加 1 次，由單位增長(zhǎng)速率決定其加入量。pH值的控制主要通過(guò)加葡萄糖控制pH,但加油多少對(duì)pH也有影響，當(dāng)油量加入較多時(shí) 要適當(dāng)減少葡萄糖的量。一般要求：絲狀菌發(fā)酵 pH6.26.4 ;球狀菌發(fā)酵 pH6.77.0 o如果超過(guò)7.0,容易產(chǎn)生水解反應(yīng)，降低產(chǎn)量。如果pH上升，可以加糖，油脂，硫酸，或硫酸錢等無(wú)機(jī)氮源；如果pH值下降，可加入碳酸鈣，氫氧化鈉，氨水或尿素，也可以增加通氣量。生產(chǎn)實(shí)踐證明，用控制加糖量和加氮量的多少來(lái)調(diào)節(jié) pH比用加酸、堿

14、直接 調(diào)節(jié)pH的效果要好。加糖、氮一方面可以調(diào)節(jié)pH,另一方面也可增加培養(yǎng)基的 營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)青霉菌的生長(zhǎng)；而直接用堿、酸來(lái)調(diào)節(jié) pH常常會(huì)調(diào)控過(guò)度，對(duì)青霉 菌生長(zhǎng)、青霉素合成不利。溫度的控制青霉菌的生長(zhǎng)適宜溫度約30，而分泌青霉素的溫度是20左右，現(xiàn)在生產(chǎn)上均采用變溫控制法，使之將發(fā)酵溫度從26逐步降低至22，則可以延緩菌絲衰老，增加培養(yǎng)液中的溶氧濃度，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，有利于增加青霉素的合成和分泌，提高青霉素的產(chǎn)量。一般絲狀菌發(fā)酵的溫度按照 26 C - 24 C -23 C -22 C控制；球狀菌發(fā)酵則 按照26C -25c - 24C控制為宜。溶氧溶氧濃度是影響發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃

15、度降低到飽和度的30%以下時(shí)， 青霉素的產(chǎn)率急劇下降，低于10%， 則造成青霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌不可逆的損害。 溶氧濃度過(guò)高，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)不良，對(duì)青霉素生產(chǎn)同樣不利。故在發(fā)酵過(guò)程中，要通入一定量的空氣，并不斷進(jìn)行攪拌，保證發(fā)酵液的溶氧濃度。一般通氣比為1:1-0.8（ 體積 /體積 /分 , V/V/min） 左右。攪拌的速度因發(fā)酵前期主要是菌體生長(zhǎng)繁殖而應(yīng)高些，發(fā)酵中后期降低轉(zhuǎn)速不但能節(jié)約電能消耗，而且有利于青霉素的合成分泌，提高發(fā)酵單位。發(fā)酵罐的攪拌速度一般以150-300r/min 為宜。泡沫的控制青霉素的發(fā)酵過(guò)程不斷產(chǎn)生泡沫，為了使發(fā)酵順利進(jìn)行，應(yīng)消除過(guò)多的泡沫。以往多用豆油、玉米油等天然油

16、脂消泡。這種消沫方法效果不佳，而且經(jīng)濟(jì)上不合算， 現(xiàn)多改用 “泡敵” 消沫或用 “泡敵” 與天然油脂交替使用來(lái)消去泡沫。但天然油脂不能多加，多加油會(huì)影響青霉素的呼吸代謝。（ 4）染菌以及異常情況的處理發(fā)酵罐發(fā)酵前期或種子罐染有雜菌，則應(yīng)該重新消毒滅菌，補(bǔ)充一定的碳、氮量后， 可接菌發(fā)酵。發(fā)酵中后期發(fā)生污染，如果是產(chǎn)生細(xì)菌或噬菌體，則應(yīng)及時(shí)放罐過(guò)濾，提取精制已產(chǎn)生的青霉素，事后進(jìn)行徹底的消毒滅菌處理。如果發(fā)酵前期菌絲生長(zhǎng)不良，引起發(fā)酵異常，則可以采取倒出部分發(fā)酵液，重新補(bǔ)入新鮮的培養(yǎng)基和優(yōu)良的種子，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。2.5 青霉素的提取與精制青霉素在發(fā)酵液中的含量不到4%，而且發(fā)酵液中含有大量的無(wú)機(jī)

17、、有機(jī)雜質(zhì)。含有大量雜質(zhì)的發(fā)酵液是不能直接用于臨床的，而且青霉素在水溶液中也不穩(wěn)定，故必須及時(shí)將青霉素從發(fā)酵液中提取出來(lái)，并通過(guò)逐步純化，得到較純的晶體或粉末，用于臨床。青霉素的鈉、鉀鹽在水中的溶解度很大，但芐青霉素本身在有機(jī)溶劑中的溶解度很大。溶劑萃取法提取青霉素就是利用這一性質(zhì)，將青霉素在酸性溶液中轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑中，并除去水溶性雜質(zhì)。分離后再轉(zhuǎn)入中性水中，除去脂溶性雜質(zhì)。經(jīng)過(guò)這樣反復(fù)幾次萃取，就能達(dá)到提純和濃縮的目的。由于青霉素不穩(wěn)定，整個(gè)提煉過(guò)程應(yīng)該在低溫、快速條件下進(jìn)行，并且嚴(yán)格控制pH,減少提煉過(guò)程中青霉素的損失。2.5.1 發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾發(fā)酵液在放罐后要及時(shí)冷卻，因青霉素在低溫

18、下較穩(wěn)定，降溫可以避免青霉素的迅速分解。然后進(jìn)行第一次過(guò)濾，目的是濾去菌絲體，方法是用鼓式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。為了得到較多的發(fā)酵液和縮短過(guò)濾時(shí)間，一般要求在發(fā)酵菌絲自溶之前放罐。通常第一次過(guò)濾的濾液，pH值在6.27.2之間，略發(fā)渾，呈棕黃色或棕綠 色，液體中含有較多的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。這些雜質(zhì)必須除去才能在以后的提取中較順利地提出青霉素，故必須進(jìn)行第二次過(guò)濾。方法是用10%硫酸調(diào)pH4.55.0,加0.07 % （W/V）的澳代十五烷 叱咯（PPB ,同時(shí)加入0.07 % （W/V）的硅藻土作為助濾劑，通過(guò)板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾 即可。二次濾液一般澄清透明，可送去提煉。2.5.2 萃取（ 1）萃取方法青霉素在pH2.5的酸性條件下，在醋酸丁酯（BA）或醋酸戊酯的溶解度比水 大幾十倍，所以二次濾液用10%勺硫酸將pH調(diào)至2.02.5 ,再用醋酸丁酯或醋 酸戊酯進(jìn)行逆流萃取。此時(shí)青霉素和大部分酸性較弱的有機(jī)酸萃取到酯中，而酸性較強(qiáng)的有機(jī)鹽、無(wú)機(jī)雜質(zhì)、堿性化合物等雜質(zhì)就留在發(fā)酵液中；當(dāng)青霉素從酯中反萃取到水中，大部分有機(jī)酸則留在酯溶液中，只有和青霉素酸性很近的有機(jī)酸才和青霉素一起轉(zhuǎn)移。這部分雜質(zhì)只有在精制中才能除去。（ 2）影響青霉素提取的因素青霉素萃取收率的高低，除了與萃取溶劑、破乳化劑和離心分離設(shè)備有關(guān)外，還和以下因素有關(guān)：pH值、溫度、時(shí)間、萃取方式和濃縮比2.5.3 結(jié)晶結(jié)晶是提