傳統ES打靶基因敲除敲入小鼠技術

1、傳統ES打靶基因敲除/敲入小鼠技術技術原理傳統的基因打靶技術制備基因敲除（KO ） /敲入（KI）基因打靶技術是建立在 DNA同源重組與胚胎干細胞等技術基礎上的分子生物學技術。同源重組是指當外源 DNA片段與宿主基因組片段同源性高時，同源DNA區(qū)部分可與宿主DNA的相應片段發(fā)生交換（即同源重組）?；虼虬芯褪峭ㄟ^同源重組技術將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的。基因打靶技術目前已被廣泛認為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質的最佳方法。尤其是條件性和誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因在時間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加精確可靠，

2、該技術的發(fā)展已經為發(fā)育生物學、 分子遺傳學、免疫學及醫(yī)學等學科提供了一個全新的、強有力的研究和治療手段，并已顯示出巨大的應用前景及商業(yè)價值。Homologous Recombination服務流程和周期Translar vector mlo «mbfyortoc stem cellsS«)»dK>n<rf ES Call cairying knockout gene m 3n(ri>iotic-canta<ning medvniAmpiihution of ES Cell csnying kn(xA«it geneTargebng

3、 Wactw Constructi理Mad ES ceils mto evly fimtNyofInjected en如yg inlo peudo-pregnaril fematsQfrrmNn* cH* 朋耐i擁 tr&ft ES打靶載體設計和構建(1-3另)ES電轉和陽性克隆篩選2-3月ES顯微注射和謹合體制備(2-3月)F1代小鼠繁殖和鑒定(2個月小鼠品系ES細胞品系：129(agouti )、C57BL/6N (black)、C57BL/6(agouti )?；虼虬谐Ｓ眯∈竽Ｐ?1 )完全性基因敲除小鼠( Conventional Knockout , KO )完全性基因敲除

4、是通過基因敲除技術，把需要敲除目的基因的所有外顯子或幾個重要的外顯子或者功能區(qū)域敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。應用：用于研究某個基因(要求該基因非胚胎致死性基因)對全身生理病理的功能。Z, l AdeleTargeted AlleleKO Al仍殆 (after Cre)I LobP jHorndosv| En(2) 條件性基因敲除小鼠( Co nditio nal Kn ockout, CKO)條件性基因敲除是通過基因敲除把兩個loxp位點放到目的基因一個或幾個重要的外顯子的兩端制備出floxed小鼠， 該floxed小鼠在與表達 Cre酶小鼠雜交之前，該目的基

5、因 表達完全正常，而當該 floxed小鼠與組織特異性表達 Cre酶的小鼠進行雜交后，可以在特 定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細胞表達正常。應用：用于具有胚胎致死性目的基因的研究；用于研究基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能；與控制Cre或Flp表達的其它誘導系統相結合，還可以對某一基因的表達同時 實現在時間和空間兩方面的調控。TarijHing Vectoi1 2 1 -N *5 «rm1cKO2jqp ；1叮i驀丁34largfltMd AllelB卜1-41Wt All«ksCondi KO AlleleMatter Flp；Condi KO Ml

6、elaCr*.基因敲入小鼠(Knockin ， KI)基因敲入可以在目的基因位置引進特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點 突變（模擬人類遺傳疾病模型）；或將報告基因（如EGFP, mRFP，mCherry ，mYFP，或LacZ 等）通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點，從而可以通過報告基因的表達跟蹤目標基因的表達。通過報告基因的表達可以研究基因的表達譜。也可以用報告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同時發(fā)生。應用：用于藥物篩選相關研究；用于信號通路的研究；用于示蹤的相關研究。wi AjieleTarg-ring VeclorCofldi KO Allele (after Flp

7、：Condi KO Atiele (after Crei（4）人源化小鼠（Humanized）人源化小鼠模型是指帶有功能性的人類基因、細胞或組織的小鼠模型。 這種模型通常被用于人類疾病體內研究（in vivo study）的活體替代模型。由于人類生理與動物生理有顯著的 差別，利用動物模型得到的實驗結果有時不能適用到人體上。比如，有些利用小鼠等動物模型開發(fā)的藥物在人體上并沒有效果。所以，利用轉基因或同源重組的方法，將人類基因“放置”在小鼠模型上所制備的人源化小鼠模型，大大提高了這類小鼠模型作為模擬某些人類疾病的有效性。應用：在艾滋病、癌癥、傳染病、人類退化性疾病、血液病研究領域等都有廣泛的應用；

8、 藥物臨床前模擬實驗。Targeting VectorTargetffd AlleleHumanized AlleleFlp KO Albe（ahe< ere）W1 AlleleLa in3 armJ'armi八訊一+ L*xf 目 FhH< rtskjgy armKi nsQon | nwjwtion | tiuffwt txdn(5) KO First基因敲除小鼠KO-First技術是通過在內含子中插入一個兩邊帶有FRT位點的基因破壞盒來達到敲除的目的，這個破壞盒含有Splice acceptor ，報告基因和 Neo。除此之外，在目的基因敲除的外顯子兩側各插入兩個LoxP位點。因此得到的小鼠是目的基因敲除同時敲入報告基因與抗性基因的小鼠。 通過靈活選擇 Cre/LoxP重組系統或者Flp/FRT重組系統，可達到同時獲 得完全性敲除和條件性敲除的實驗目的。即當該小鼠與表達Cre的小鼠交配時，可獲得目的基因敲除同時敲進報告基因的小鼠；當該小鼠與Flp小鼠交配時，可還原已敲除基因的表達，獲得基因條件性敲除小鼠，在此基礎上Cre小鼠交配又可獲得目的基因敲除小鼠。Cyagen KO-First曰E2E3Wlk