雙抗體夾心法

1、1 .雙抗體夾心法雙抗體夾心法,屬于非競爭結(jié)合測定.它是檢測抗原最常用的 ELISA,適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原,而 不能用于小分子半抗原的檢測.其根本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物.由于反響系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的 量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量 成正比在方法可檢測范圍內(nèi).測定復(fù)合物中的酶作用于參加的底物 后生成的有色物質(zhì)量OD值,即可確定待測抗原含量. 假設(shè)固相載體 上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗 原決定簇

2、結(jié)合,那么屬于雙位點夾心法.假設(shè)采用固相載體上的抗原和酶 標抗原分別與樣品中被檢測抗體分子結(jié)合,那么是雙抗原夾心法.操作步驟：將特異性抗體包被固相載體McAb孵育一定時間,使形成固相 抗體,洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì).加待檢標本,孵育,使標本中的抗原與固相載體上的抗體充分 反響,形成固相抗原抗體復(fù)合物.洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì).加酶標抗體,孵育,使形成固相抗體-待測抗原-酶標抗體夾心 復(fù)合物.洗滌除去未結(jié)合酶標抗體.加底物顯色.固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物 ,通過比色,測 標本中抗原的量.現(xiàn)多采用針對單一抗原決定簇特異性的單克隆抗體做固相化和 酶標抗體,那么受檢樣品和酶標抗體可一次性參加,簡化

3、流程,縮短反 應(yīng)時間.假設(shè)標本中待測抗原濃度過高,抗原可分別與酶標抗體和固相 抗體結(jié)合而不形成上述夾心復(fù)合物類似于免疫沉淀反響中抗原過剩 時的后帶現(xiàn)象,使最終結(jié)果低于實際含量鉤狀效應(yīng),甚至出現(xiàn)假 陰性現(xiàn)象.因此對此類標本應(yīng)適當(dāng)稀釋后再測定.另外,當(dāng)血清中存 在類風(fēng)濕因子RF3時,類風(fēng)濕因子RF可充當(dāng)抗原,而形成固相 抗體-類風(fēng)濕因子-酶標抗體夾心復(fù)合物,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果.2 .間接法此法是測定抗體最常用的方法,屬非競爭結(jié)合試驗.其原理是將 抗原連接到固相載體上,樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物,再用酶標二抗針對受檢抗體的抗體,如羊抗人IgG抗 體與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合,

4、形成固相抗原 -受檢抗體-酶標 二抗復(fù)合物,測定加底物后的顯色程度,確定待測抗體含量.操作步驟將抗原包被固相載體,形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的 抗原及雜質(zhì).封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉,阻止待檢血清中非特異IgG吸 附固相.加待檢血清,孵育,使固相抗原和待檢抗體充分結(jié)合,洗滌除 去未結(jié)合的非特異抗體及其他血清成分.加酶標抗體或酶標SPA孵育,形成固相抗原-待檢抗體-酶標 抗抗體或酶標SPA渡合物.加底物顯色.間接法由于采用的酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子如抗人IgG,因此該法只需要換固相抗原,即可用一種酶標二抗檢測各種與 抗原相應(yīng)的抗體,具有更廣泛的通用性.3 .競爭法競爭法ELISA可用于

5、抗原和半抗原的定量測定,也可對抗體進行 檢測.具方法和特點是：酶標記抗原抗體與樣品或標準體中的 非標記抗原或抗體具有相同的與固相抗體抗原結(jié)合的水平；反 應(yīng)體系中,固相抗體抗原和酶標抗原抗體是固定限量,且前 者的結(jié)合位點少于酶標記與非標記抗原抗體的分子量和；免疫 反響后,結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標抗原抗體的量 酶活性與樣品或標準品中非標記抗原抗體的濃度成反比.操作步驟將抗體包被載體,形成固相抗體.洗滌除去未結(jié)合物.參加待檢標本和酶標抗原,孵育,使兩者與固相抗體競爭結(jié)合. 洗滌除去未結(jié)合到固相上的游離酶標抗原及其他未結(jié)合物.加底物顯色.顏色深淺與待測抗原量成反比.同理,也可用固相抗原和酶

6、標抗體作試劑, 使固相抗原和標本中 的待檢抗原競爭結(jié)合酶標抗體.待檢抗原競爭抑制酶標抗體和固相抗 原結(jié)合,即待檢抗原越多,顯色越淺.以抗原測定為例,先將特異性抗體連接于固相載體,分別設(shè)置對照管和樣品測定管；對照管中僅加酶標抗原,加樣后,無非標記抗原 競爭,酶標抗原即與固相抗體充分結(jié)合；而測定管抗原與后者的結(jié)合 受到抑制而減少.加酶底物顯色后,對照管因固相抗體上結(jié)合的酶標 抗原多,顯色深,測定管那么依被檢抗原和酶標抗原競爭結(jié)合固相抗體 程度不同而顯色深淺有異：被檢抗原多,酶標抗原與固相抗體結(jié)合少, 底物顯色反響弱,色淺；反之呈色深.即結(jié)合于固相的酶標抗原量與 樣品中被檢抗原濃度負相關(guān).計算測定管

7、與對照管顏色深度OD直之差,即可確定被檢抗原量.4 .捕獲法捕獲法亦稱反向間接法ELISA,主要用于血清中某種抗體亞 型成分如IgM的測定.以目前最常用的IgM測定為例,因血清中 針對某種抗原的特異性IgM和IgG同時存在,那么后者可干擾IgM的測 定.因此捕獲法的工作原理設(shè)計為：先將針對IgM的第二抗體如羊 抗人IgM區(qū)鏈抗體連接于固相載體,用以結(jié)合“捕獲樣品中所 有IgM 特異或非特異,洗滌出去IgG等無關(guān)物質(zhì),然后參加特異 抗原與待檢IgM結(jié)合；再參加抗原特異的酶標抗體,最后形成固相二 抗-IgM-抗原-酶標抗體復(fù)合物,加酶底物作用顯色后,即可對樣品 中待檢IgM是否存在及其含量進行測定

8、.5 .其他ELSAELSA法由于測定靈敏、特異、操作簡便、易于自動化,且無放 射性污染等諸多優(yōu)點,使其不僅成為目前應(yīng)用最廣而且開展最快的一 種免疫測定技術(shù).而且在方法學(xué)上的改良和衍化,使其不斷有各具特 點的新測定法問世,如應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)(biotin-axidin system, BA0白ELISA;利用酶催化底物發(fā)熒光的酶聯(lián)免疫熒光測 定 (enzymelinked immunofluorecence assay, ELFIA), 斑點-ELISA(dot-ELISA )和酶聯(lián)免疫 電轉(zhuǎn)移 印跡法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot

9、 , EITB)以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光測定(enzyme linked immunochemiluminescence assay , ELICLA) 等.新方法不僅進一步提升了測定靈敏、 特異性,而且使ELISA技術(shù)在提 高自動化程度的同時,也便于單份樣本測定和簡化設(shè)備條件, 尤其試 用于急診、社區(qū)診所及家庭化驗.膜載體的酶免疫測定固相膜免疫測定(solid phase membrane-based immuoassay ) 與固相酶免疫測定(ELISA)相類似,其特點是以微孔膜作為固相. 標記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金、膠體硒等, 以紅色的膠體金最為常用.固相膜的特點在于其

10、多孔性,像濾紙一樣. 固相膜可被液體穿過流出,液體也可以通過毛細管作用在膜上向前移 行.利用這種性能建立了兩種不同類型的快速檢測方法.常用的固相膜為硝酸纖維素(nitrocellulose , NC膜.斑點酶免疫吸附試驗斑點-ELISA (dot-ELISA)實驗原理與常規(guī)的ELISA相同,不同之 處在于斑點-ELISA所用載體為蛋白質(zhì)具有極強吸附力(近 100%的 硝酸纖維素(NC膜,此外酶作用底物后形成有色的沉淀物,使 NC 染色實驗方法為：加少量(12區(qū)l)抗原于膜上,由于NC膜吸附能力強,故需在枯燥后進行封閉；然后滴加樣品血清,其中的待檢抗體 即與NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標二抗

11、,最后滴加能形成不 溶有色物的底物溶液如 HRP記物,常用二氨基聯(lián)苯胺；陽性者 即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點.斑點-ELISA的優(yōu)點為：NCI 吸附蛋白力強,微量抗原吸附完全,故檢出靈敏度可較普通ELISA高68倍；試劑用量教ELISA節(jié)約約10倍；操作簡單,實驗及結(jié)果 判斷不需特殊設(shè)備條件；吸附抗原抗體或已有結(jié)果的NC膜可長期保存-20 C可長達半年,不影響其活性.免疫滲濾實驗免疫滲濾實驗IFA的根本原理是：一硝酸纖維素NC膜為載 體,利用微孔濾膜的可濾過性,使抗原抗體反響和洗滌在一特殊的滲 濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成. 免疫滲濾實驗最初是從斑 點ELISA根底上開展建立起來的

12、,應(yīng)用的結(jié)合物是酶標記的.20世紀90年代初開展了以膠體金為標記物的金免疫滲濾實驗GIFA,省卻了酶對底物的反響,更加簡單、快速.滲濾裝置是IFA中的主要試 劑成分之一,由塑料小盒、吸水塑料和點加了抗原或抗體的硝酸纖維 素膜片三局部著稱.塑料小盒可以是多種形狀的,盒蓋的中央有一直 徑約為0.40.8cm的小圓吸孔,盒內(nèi)墊放吸水塑料,NC膜片安放在 正對盒蓋的圓孔下,緊密關(guān)閉盒蓋,是 NC膜片貼緊水塑料.如此即 制備成一滲濾裝置.整個反響過程都在滲濾裝置中進行,因此又常稱 位扁平長方形滲濾裝置為反響板.以雙抗體夾心HC吩例,于小孔內(nèi)滴加標本12滴,待完全滲入.此時標本中的HCGW NC膜上的抗3

13、 HCGffi結(jié)合.再于小孔內(nèi)滴加結(jié) 合物試劑12滴,待完全滲入,金標記的抗 HCGt體與NC膜上的 HC或成雙抗體夾心復(fù)合物.因膠體金為紅色,在 NC膜上出現(xiàn)紅色 斑點.在膜中央有清楚的淡紅色或紅色斑點顯示者判斷為陽性反響； 反之,那么為陰性反響,斑點呈色的深淺相應(yīng)地提示陽性強度. 有將包 被斑點由圓點式改成短線條式的：質(zhì)控斑點橫向包被成橫線條,如“一反響斑點縱向包被成豎線條,如“ I ；兩者相交成“ +.這 樣,陽性反響結(jié)果在膜上顯示紅色的正號+,陰性結(jié)果那么為負號一,目視判斷直觀、明了.免疫層析實驗免疫層析實驗ICA是繼IFA之后反站起來的另一種膜固相免疫 測定.與IFA利用微孔膜的過濾

14、性能不同,ICA中滴加在膜一端的樣 品溶液受膜的毛細管作用向另一端移動, 猶如層析一般.移動過程中 被分析物與固定于膜上某一區(qū)域的抗原或抗體結(jié)合而被固相化,無關(guān)物質(zhì)那么越過該區(qū)域而被別離,然后通過標記物的顯色來判定實驗結(jié) 果.以膠體金為標記物的實驗稱為金免疫層析實驗 GICA.ICA中 所用的試劑全部為干試劑,它們被組合在一試劑條上.試劑條的底版 為一單面膠塑料片,A、B兩端粘貼有吸水材料.加樣端 A為樣品墊, 可用的材料有濾紙、多孔聚乙烯和玻璃纖維等,按分析物和試劑的不 同選擇適宜的材料.B端為吸水墊,材料那么為吸水性強的濾紙為佳.G處為結(jié)合物墊,膠體金結(jié)合物枯燥固定在玻璃纖維膜等材料上.

15、G B之間粘貼吸附有抗原或抗體的硝酸纖維素膜, 抗原或抗體往往以直線的形式包被在膜上.一雙抗體夾心法測HC例.試條中G處為金標記的抗0c HCGNC膜上T處包被抗3 HCGC處包被抗小鼠IgG抗體.測試時在A端加尿液或?qū)端浸入尿液中,通過層析做HCG-HCG 復(fù)合物；移行至T區(qū),形成金-抗-HCG-HCGB HCGS合物,在T 區(qū)顯示紅色線條,為陽性反響.多余的金標記抗HCG行至C區(qū)時被抗小鼠IgG抗體捕獲,而顯示出紅色對照線條.如尿液中不含HCG 在T區(qū)不出現(xiàn)紅色線條,僅在 C區(qū)出現(xiàn)紅色線條,實驗結(jié)果為陰性.如C區(qū)無紅色線條出現(xiàn),表示實驗無效.雙抗體夾心法加底物顯色.固相上的酶催化底物產(chǎn)生

16、有色產(chǎn)物 ,通過比色,測 標本中抗原的量.雙位點一步法操作步驟將1個McAbW固相載體聯(lián)結(jié),形成固相McAb洗滌除去未結(jié)合 物.同時參加待測標本和酶標 McAb,孵育,使待檢抗原和固相 McAb 及酶標McAb反響形成雙抗體夾心復(fù)合物.洗滌除去未結(jié)合物.加底物顯色.間接法操作步驟將抗原包被固相載體,形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的 抗原及雜質(zhì)封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉,阻止待檢血清中非特異IgG吸 附固相.加待檢血清,孵育,使固相抗原和待檢抗體充分結(jié)合,洗滌除去 未結(jié)合的非特異抗體及其他血清成分.加酶標抗體或酶標SPA螭育,形成固相抗原-待檢抗體-酶標抗 抗體或酶標SPA渡合物.加底物顯色.雙抗原夾心法操作步驟將抗原包被固相載體,形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合物.參加待檢標本,孵育,使待檢抗體和固相結(jié)合.洗滌除去未結(jié)合 物.參加酶標抗原,孵育,形成固相抗原-待檢抗體-酶標抗