細菌感染的檢查方法與防治原則

1、第 7 章細菌感染的檢查方法與防治原則盡管有預防措施和宿主防御功能，但細菌感染性疾病經(jīng)常發(fā)生。因此，快速、 準確地作出病原學診斷，有助于制定正確的防治方案。根據(jù)臨床癥狀與體征，采集 合適的臨床標本，進行細菌學和血清學檢驗，在確診病因上極為重要。特異性防治 是應(yīng)用獲得性免疫的原理，給機體注射病原微生物的抗原（包括類毒素）、抗原編碼 基因或特異性抗體血清等，使其獲得特異性免疫力，以達到有效防治感染性疾病的 目的。細菌感染性疾病的特異治療主要是采用抗菌藥物，但細菌的耐藥性問題已日 趨嚴重。第一節(jié)細菌感染的實驗室診斷實驗室診斷主要包括以檢測致病菌及其抗原、 產(chǎn)物或核酸為目的的細菌學診斷, 以及檢測患者

2、血清中特異性抗體為目的的血清學診斷。、細菌學診斷（一）標本采集細菌感染性疾病的實驗室檢查結(jié)果主要取決于臨床標本的質(zhì)量、采集時間及方 法、實驗人員的技術(shù)熟練程度及經(jīng)驗。臨床醫(yī)生應(yīng)該知道何時和怎樣采取標本，需 作哪些實驗室檢查，以及如何解釋結(jié)果。為提高致病菌檢出率，避免診斷錯誤或漏 檢，標本采集與送檢過程應(yīng)遵循下列原則：1.嚴格執(zhí)行無菌操作，盡量避免患者正常菌群或外界環(huán)境中雜菌污染標本。 采 取局部病變標本處，不可用消毒劑，必要時宜以無菌生理鹽水沖洗，拭干后再取材。 從呼吸道、消化道、泌尿生殖道、傷口或體表分離可疑致病菌時，應(yīng)與其特定部位的正常菌群及臨床表現(xiàn)一并加以考慮，因為目前內(nèi)源性感染呈不斷上

3、升趨勢。2.根據(jù)致病菌在患者不同病期的體內(nèi)分布和排出部位，米集不同的標本（表7-1）。例如流行性腦膜炎患者取腦脊液、血液或出血瘀斑；傷寒患者在病程第12周內(nèi)取血液，第23周時可取糞便。盡可能采集病變明顯部位的材料。表 7-1 臨床標本中常見病原菌臨床標本常見病原菌血液金黃色葡萄球菌、腸球菌、肺炎鏈球菌、甲型鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、大腸埃希菌、肺炎克氏菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌咽拭子A A 群溶血性鏈球菌、白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌痰結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克氏菌、銅綠假單胞菌、百日咳鮑特菌、嗜肺軍團菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體腦脊液腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、

4、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌糞便志賀菌、沙門菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、艱難梭菌、脆弱類桿菌尿大腸埃希菌、凝固酶陰性葡萄球菌、變形桿菌、腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸球菌淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、梅毒螺旋體、陰道加德納菌、白假絲酵母菌 金黃色葡萄球菌、A A 群溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭生殖道分泌物傷口及膿腫菌、脆弱類桿菌胃竇和胃體粘幽門螺桿菌 膜3應(yīng)在疾病早期和使用抗菌藥物之前采集標本，否則可能需停藥數(shù)天后采集， 或者在分離培養(yǎng)時加入藥物拮抗劑。4.標本必須新鮮，采集后盡快送檢，尤其是檢測抵抗力弱的細菌。若不能立即 送檢，應(yīng)將標本置于特殊的轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中，低溫

5、保存，以減緩致病菌的死亡，阻止 雜菌的過度生長。送檢過程中，除不耐寒冷的腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保溫 外，多數(shù)菌可冷藏送運。（二）致病菌的檢驗程序主要有直接涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗、血清學試驗等，有的尚需作影響臨床診斷程序選擇的重要因素1.直接涂片染色鏡檢直接涂片染色鏡檢法可在顯微鏡下直接觀察致病菌的形 態(tài)、大小、排列方式和染色特點。凡在形態(tài)和染色性上具有特征的致病菌，直接涂 片染色后鏡檢有助于初步診斷。 例如痰中查見抗酸性細長桿菌， 腦脊液或淤血點中 查到腎形成雙排列的革蘭陰性球菌，膿液中發(fā)現(xiàn)革蘭陽性葡萄串狀球菌，或咽喉假 膜中有異染顆粒的棒狀桿菌時，可分別初步診斷為結(jié)核分枝桿菌

6、、腦膜炎奈瑟菌、 葡萄球菌或白喉棒狀桿菌。此外，尿沉渣中發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌類，或長期腹瀉患者糞便中 發(fā)現(xiàn)革蘭陽性球菌和真菌等優(yōu)勢菌，均有重要的診斷價值。在某些情況下，也可在 直接涂片后，以特異性熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，若出現(xiàn)有發(fā)熒光的菌體就是欲檢驗的細菌。例如糞便中的志賀菌、霍亂弧菌，以及呼吸道標本中的嗜肺 軍團菌和百日咳鮑特菌等可用此技術(shù)快速檢出。染色或不染色標本的形態(tài)學檢查法較為簡便、快速、價廉，為臨床檢驗所常用， 特別是有的細菌尚不易進行人工培養(yǎng)，或培養(yǎng)時周期較長，只能通過直接涂片染色 并結(jié)合臨床確診。但是，直接涂片鏡檢法的敏感性不及分離培養(yǎng)法。2分離培養(yǎng) 有很多種類的細菌在形態(tài)、排列

7、方式和染色性上不能區(qū)分，需進 行細菌的分離培養(yǎng)，這是確診細菌感染性疾病最可靠的方法 （金標準），并有助于選 用抗菌藥物及評價療效。由于各種細菌的生物學特性有所差異，所采用的培養(yǎng)基和 培養(yǎng)方法也不盡相同。從無菌部位采取的血液、腦脊液等標本，可直接接種至營養(yǎng)豐富的液體或固體 培養(yǎng)基；從正常菌群存在部位采取的標本，應(yīng)接種至選擇或鑒別培養(yǎng)基。接種后置37C孵育，一般需氧菌經(jīng)1620小時大多可形成菌落 （colony） ,厭氧菌和微需氧 菌通常需23天才形成菌落。少數(shù)菌如布氏菌、結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，分別需培 養(yǎng)34周和48周才長成可見菌落。根據(jù)細菌所需要的營養(yǎng)、生長條件、菌落特 征可作初步鑒別，確診還

8、需對純培養(yǎng)物進行形態(tài)特征、生化試驗和血清學試驗鑒定。 分離培養(yǎng)法的陽性率要比直接涂片鏡檢高，但需時較久。因此，遇白喉、氣性壞疽 等急性傳染病時，可根據(jù)患者臨床表現(xiàn)和直接涂片鏡檢結(jié)果作出初步診斷并及時治 療，不必等待分離培養(yǎng)報告，以免貽誤治療時間。3.生化試驗 細菌的代謝活動依靠一系列酶的催化作用。不同細菌具有不同的酶系，對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及其代謝產(chǎn)物不盡相同。檢測細菌對各種基質(zhì)（如糖 類和蛋白質(zhì)）的代謝作用和代謝產(chǎn)物的差異，借以區(qū)別和鑒定細菌，稱之為細菌的 生化試驗（biochemicaltesting）。例如幽門螺桿菌產(chǎn)生極強的尿素酶，可分解尿素產(chǎn) 生氨，使培養(yǎng)液呈堿性，pH指示劑則改變顏

9、色。生化試驗對菌體形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和菌落特征相同或相似的細菌（如腸道桿菌）的鑒定尤為重要?，F(xiàn)代臨床細菌學已普遍采用微量、快速、半自動化或自動化的細菌生化鑒定和 細菌藥敏分析系統(tǒng)，使細菌檢出水平明顯提高，所需時間大為縮短，推進了相關(guān)標 本鑒定的準確性與時效性。 其中，VITEK-AMS系統(tǒng)可鑒定細菌和真菌200300多 種及近100種不同抗菌藥物的敏感性測試。細菌鑒定原理是根據(jù)不同細菌的理化性 質(zhì)不同，采用光電比色法，測定細菌分解底物導致pH改變而產(chǎn)生的不同顏色，來判斷反應(yīng)的結(jié)果。4.血清學試驗 在許多情況下，難以從患者的臨床標本中分離出致病菌，特別 是在發(fā)病早期已用抗生素等藥物治療過的患者，

10、因致病菌的生長被抑制或殺死，可 明顯影響致病菌的檢出率。但是，采用 血清學試驗（serological testing），即用含有 已知的特異性抗體的免疫血清，可快速、準確地檢出臨床標本中極微量的致病菌特 異抗原，亦可鑒定分離培養(yǎng)出的未知純種細菌，并可確定致病菌的種或型，有助于 確定病因。常用方法有凝集試驗（如玻片凝集試驗、協(xié)同凝集試驗、乳膠凝集試驗、 反向間接血凝試驗）、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等。5.動物試驗 利用動物實驗，可進行致病菌的分離與鑒定、細菌毒力的檢測等。 常用實驗動物有小鼠、豚鼠和家兔等。應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康?，選用一定體重或年齡的高 度易感性的健康動物。接種途徑有注

11、射（皮內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內(nèi)）和灌胃等。接種后應(yīng)仔細觀察動物的食量、精神狀態(tài)和局部變化等。若動物出現(xiàn)特 有的癥狀或死亡，應(yīng)立即解剖，檢查病變，或作細菌分離培養(yǎng)，證實由何種致病菌 所致。動物實驗一般不作為常規(guī)細菌學診斷。6.基因診斷技術(shù) 核酸雜交和PCR技術(shù)不需分離培養(yǎng)，只需檢測標本中致病 菌的特異性核酸片段，即可鑒定出致病菌，具有特異性強、敏感度高、快速等特點， 尤其適用于檢測難以或不能培養(yǎng)的致病菌（如梅毒螺旋體），以及培養(yǎng)時間較長或培 養(yǎng)條件苛刻的致病菌（如立克次體、衣原體、結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌、空腸彎 曲菌、嗜肺軍團菌和無芽胞厭氧菌等）。（1）核酸雜交技術(shù)：原理是應(yīng)用放射性核

12、素或生物素、地高辛、辣根過氧化物酶、熒光素等非放射性物質(zhì)標記的已知序列單鏈核酸（如16SrRNA編碼基因中的 保守序列）作為探針（probe），在一定條件下，根據(jù)堿基配對原則，與待測標本的 同源或部分同源核酸單鏈退火，形成雙鏈雜交體。然后，通過雜交信號的檢測，鑒 定臨床標本（如血清、尿、糞便或活檢組織）中有無相應(yīng)的病原體特異基因。核酸雜交過程可在溶液中進行（液相雜交），也可使探針DNA結(jié)合到固相載體 （如硝酸纖維膜）上，或使組織中DNA雙鏈打開，然后進行雜交（固相雜交）。固 相核酸雜交較為常用，有原位雜交（in situ hybridization）、斑點雜交（dot blot）、Southe

13、rn印跡、Northern印跡等。核酸雜交可直接檢出標本中的致病菌，不受標本 中的雜質(zhì)干擾，對尚不能或難分離培養(yǎng)的致病菌尤為適用，亦可同時檢出多種致病 菌。(2)PCR技術(shù)：是一種體外擴增特異性DNA片段的技術(shù)，具有快速、靈敏度高和特異性強等特點。其基本步驟是，從標本中提取DNA作為擴增模板，選用一對人工合成的特異寡核苷酸作為引物，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶作用下，經(jīng)不同溫度的變性、退火、延伸，多次循環(huán)后，即可在數(shù)小時內(nèi)獲得數(shù)百萬個特異性DNA序列的拷貝。擴增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，即可確定要擴增的目的DNA存在與否。若需進一步鑒定，可從凝膠中分離和回收PCR產(chǎn)物，再用標記的特異探針確定

14、，或直接測序分析。目前，PCR技術(shù)和由此發(fā)展而來的逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptase PCR, RT-PCR、定量實時熒光PCR(real-time PCR)等技術(shù) 已廣泛用于感染性疾病的基因診斷。(3)|DNA芯片(DNA array)|技術(shù)：又稱基因芯片(gene chip技術(shù)，由核酸雜交技術(shù)衍生而來。其基本原理是：首先，將大量的特異寡核苷酸探針有序地、高 密度地點布并固定在硅片、玻片等固相支持物上，組成DNA微點陣(microarray)，即DNA芯片；然后，抽提待檢樣本中的DNA或mRNA，用熒光染料標記后，與DNA芯片上的探針雜交，應(yīng)用激光共聚焦顯微掃描技術(shù)，記

15、錄雜交結(jié)果；最后，應(yīng) 用分析軟件，對雜交位點及其信號強弱進行分析，找出差異表達的基因，判別標本 中的特異性致病菌。應(yīng)用致病菌基因組、耐藥基因、毒力基因等重要基因的芯片，通過單一雜交即可完成致病菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性快速診斷、致病菌與 非致病菌鑒定等，為臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。該技術(shù)可將許多不同類型的探 針同時固定于一張芯片上，一次可對樣品中可能存在的多種致病菌進行系統(tǒng)檢測分 析。、血清學診斷（serological diagnosi9人體受到致病菌感染后，免疫系統(tǒng)可發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生特異性抗體?？贵w的 量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價(titer)或稱滴度的升高。因此，采用已知的

16、細菌或其特異性抗原，檢測患者血清或其他體液中有無相應(yīng)特異性抗體及其效價的 動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。一般采取患者的血清進行試驗，故這類 方法通常稱為血清學診斷。血清學診斷主要適用于抗原性較強、 生化試驗不易區(qū)別、 難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的致病菌，以及病程較長的感染性疾病。在血清學診斷中，最好采取患者急性期和恢復期雙份血清標本。因為在傳染病 流行區(qū)內(nèi)，患者血清中出現(xiàn)某種抗體，除患有與該抗體相應(yīng)的疾病外，亦可因受過 該菌隱性感染或近期預防接種所致。因此，必須有抗體效價明顯高于健康人群的水 平或隨病程遞增才有診斷價值。當恢復期的抗體效價比急性期升高4倍時，即可區(qū)別既往感染或現(xiàn)癥感染。若患者在

17、疾病早期應(yīng)用抗菌藥物，致病菌在體內(nèi)繁殖不 多，抗體效價可以無明顯升高?？梢姡毦鷮W診斷和血清學診斷在細菌感染的確立 上是互為輔助的。常用于細菌性感染的血清學診斷方法列于表7-2。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA、比細菌分離培養(yǎng)快速，而且靈敏度高、特異性較強，已有各種商品化試 劑盒可自動化檢測大量標本，有逐漸替代其他血清學診斷方法之勢。已廣泛應(yīng)用于 流行病學調(diào)查和多種病原體的抗原、相應(yīng)抗體、可溶性毒素等檢測，尤其是對病毒 感染的診斷更為適合。表 7-2 細菌感染性疾病的血清學診斷血清學試驗應(yīng)用舉例直接凝集試驗傷寒、副傷寒（肥達試驗）、立克次體?。ㄍ忪吃囼灒⒉ɡ藷帷^端螺旋 體?。@微凝集試驗

18、）乳膠凝集試驗流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌感染引起的腦膜炎、梅毒、新生隱球菌感染冷凝集試驗支原體性原發(fā)性非典型肺炎沉淀試驗梅毒（VDRLVDRL、RPRRPR 試驗）、白喉毒素（ElekElek 平板毒力試驗）對流免疫電泳流行性腦脊髓膜炎補體結(jié)合試驗Q Q 熱中和試驗風濕熱（抗 0 0 試驗）免疫印跡試驗萊姆病免疫熒光試驗梅毒（FTA-ABSFTA-ABS 試驗）ELISAELISA多種病原體及其毒素、特異性抗體的檢測第二節(jié)細菌感染的免疫預防人工免疫包括人工主動免疫(artificial active immunization)和人工被動免疫(artificial passive immuni

19、zation)（表7-3），是預防細菌感染的有效措施。人工主動免疫方法通常稱為預防接種(prophylactic inoculation)或疫苗接種 （vaccination）人工被動免疫主要用于急性傳染病的治療或緊急預防。表 7-3 人工主動免疫與人工被動免疫的比較區(qū)別要點人工主動免疫人工被動免疫免疫物質(zhì)抗原抗體或細胞因子等免疫出現(xiàn)時間慢（數(shù)天 4 4 周）快（立即）免疫維持時間長（數(shù)月數(shù)年）短（2 23 3 周）主要用途預防治療或緊急預防一、人工主動免疫人工主動免疫是將疫苗（vaccine）接種于人體， 使之產(chǎn)生獲得性免疫力的一種防治微生物感染的措施。 疫苗接種可有效地降低感染性疾病的發(fā)生

20、率和死亡率。傳統(tǒng)的疫苗主要有火活疫苗 、減毒活疫苗和類毒素，但對于某些抗原性弱且易于發(fā)生免疫逃避的病原體，傳統(tǒng)疫苗往往難以獲得有效的免疫應(yīng)答及保護性。對于一些免 疫保護機制不清、可能誘導免疫病理反應(yīng)和不易培養(yǎng)的病原體，則難以用傳統(tǒng)方法 生產(chǎn)疫苗?，F(xiàn)代疫苗學的發(fā)展策略主要有：將病原微生物保護性抗原基因克隆到合適的 載體，再導入適宜的表達系統(tǒng)中表達，制成亞單位疫苗；選擇缺失基因的減毒病 原體（如卡介苗）、非致病性病毒（如腺病毒、金絲雀痘病毒）或人體生理性細菌（如 乳桿菌）等作為載體，插入致病菌抗原基因或?qū)霐y帶致病菌抗原基因的重組質(zhì)粒， 構(gòu)建成活載體疫苗，高效表達目的抗原以刺激宿主免疫系統(tǒng)；預防多

21、種疾病、接 種次數(shù)少的多價抗原聯(lián)合疫苗；利用質(zhì)粒DNA誘導免疫應(yīng)答的核酸疫苗；疫 苗的免疫增強物及對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；特定免疫原或免疫調(diào)節(jié)劑投遞的新型微粒 載體系統(tǒng)。因此，疫苗的形式從過去較單一的滅活疫苗、減毒活疫苗，發(fā)展到現(xiàn)代 的基因工程重組蛋白質(zhì)疫苗、化學合成多肽疫苗（包括表位疫苗）及核酸疫苗等新 型疫苗；疫苗的功能從預防發(fā)展到預防與治療。 疫苗總的發(fā)展趨勢是增強免疫效果， 簡化接種程序。（一） 滅活疫苗 （in activated vacci n選用免疫原性強的病原體，經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用理化方法殺死，但仍保留抗 原性而制成的生物制品，稱之為滅活疫苗。常用的滅活疫苗有百日咳、傷寒、霍亂、

22、鉤端螺旋體病、斑疹傷寒、Q熱、鼠疫等疫苗。滅活疫苗制造工藝相對簡單，免疫 原性穩(wěn)定性咼，易于制備多價疫苗，疫苗安全性咼，易于保存，一般4C可保存1年 左右。缺點主要是：接種劑量大；注射局部和全身的不良反應(yīng)較大；免疫維 持時間短，需接種多次。為減少接種手續(xù)，可將不同種類的死疫苗適當混合組成聯(lián) 合疫苗，例如傷寒和副傷寒甲、乙混合的三聯(lián)疫苗，多個型別鉤端螺旋體組成的多 價鉤端螺旋體疫苗等；滅活疫苗不能模擬病原體在宿主中的自然感染過程，主要 刺激宿主產(chǎn)生體液免疫，粘膜免疫和細胞免疫應(yīng)答不強。（二） 減毒活疫苗（live-attenuated vaccine從自然界發(fā)掘，或通過人工培育篩選，或通過基因突

23、變或重組，將病原體的毒 力降低到足以產(chǎn)生模擬自然發(fā)生隱性感染，誘發(fā)理想的免疫應(yīng)答而又不產(chǎn)生臨床癥 狀的疫苗，稱之為減毒活疫苗。例如，牛結(jié)核分枝桿菌在人工培養(yǎng)基上經(jīng)13年230次傳代后獲得的卡介苗（BCG）。與滅活疫苗相比，減毒活疫苗的最大優(yōu)點是：能模擬自然感染過程，誘發(fā)全面、 穩(wěn)定、持久的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，不需要佐劑；劑量較小，免疫 力持久，一般只需接種1次，即可達到預防目的；可采用口服、噴鼻或氣霧途徑免 疫，避免一些因注射免疫而引起的局部反應(yīng)或合并征?；钜呙绲娜秉c是：存在毒力 回復突變危險；需冷藏保存，且保存期短，但此不足可用凍干法改進劑型來克服。 免疫缺陷者和孕婦一般不宜接

24、受活疫苗接種。（三） 亞單位疫苗 （subunit vaccin亞單位疫苗是指不含病原體核酸，僅含能誘發(fā)宿主產(chǎn)生中和抗體的微生物蛋白 或表面抗原的疫苗。其突出優(yōu)點是已除去病原體中不能激發(fā)機體保護性免疫和對宿 主有害的部分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明顯增強而穩(wěn)定，可消除 減毒活疫苗的回復突變和滅活疫苗的感染性復活作用，對機體引起的不良反應(yīng)越來 越小。亞單位疫苗可分為：1非重組的亞單位疫苗是由單個蛋白或寡糖組成的疫苗，采用化學方法將這些免疫原物質(zhì)予以抽取、純化。例如肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌的 主要保護性免疫原是莢膜多糖，白喉棒狀桿菌和破傷風梭菌是外毒素；鉤端螺旋體 和疏螺

25、旋體是外膜蛋白等。莢膜多糖疫苗的免疫原性較弱，需與佐劑或免疫原性強 的抗原（如破傷風類毒素、白喉類毒素）等結(jié)合成偶聯(lián)疫苗（conjugate vacci ne，以增強多糖免疫原的應(yīng)答反應(yīng)。細菌外毒素經(jīng)0.3%0.4%甲醛處理后，失去毒性但 仍保持免疫原性，成為類毒素（toxoid）。加入適量磷酸鋁或氫氧化鋁等吸附型佐劑 則成為精制的類毒素。它們在機體內(nèi)吸收緩慢、能較長時間刺激機體，可以增強免 疫效果，誘導機體產(chǎn)生抗毒素。常用的白百破三聯(lián)疫苗是將滅活的百日咳鮑特菌與 白喉、破傷風兩種類毒素混合而成。優(yōu)點是不僅可減少接種次數(shù)，且百日咳鮑特菌 是有效的佐劑，能增強白喉和破傷風類毒素的免疫效果。2.基

26、因重組亞單位疫苗是將病原體保護性抗原基因克隆至載體質(zhì)粒，在合適的表達系統(tǒng)（如大腸埃希菌、畢氏酵母菌）中獲得高效表達，將免疫原分離純化而 制成的疫苗。最成功的是乙型肝炎基因工程疫苗。近年來，以微生物基因組學為平 臺，應(yīng)用生物信息學、蛋白組學和體內(nèi)表達技術(shù)（in vivo expression tech no logy等, 預測和尋找致病菌毒力或毒力相關(guān)抗原、分泌蛋白抗原和外膜蛋白抗原等，對上述 抗原的編碼基因進行高通量表達，再對純化重組蛋白進行體外和體內(nèi)免疫學分析，篩選出有效的保護性抗原，可大大加快疫苗的研究進程。此外，采用細菌表面展示 技術(shù)（surface display in bacteri

27、a，將外源性抗原肽或蛋白與細菌表面的細胞壁蛋白 或外膜蛋白融合，以正確的構(gòu)象和方向插入并錨定在細胞壁或外膜表面，可構(gòu)建成 重組亞單位疫苗。（四） 核酸疫苗（nucleic acid vaccine核酸疫苗，又稱DNA疫苗（DNA vaccine）或基因疫苗（gene vaccin，是指 將病原體保護性抗原基因片段克隆到真核表達質(zhì)粒上，然后直接導入宿主體內(nèi)，以 持續(xù)表達目的免疫原，進而誘發(fā)保護性體液免疫和細胞免疫的新型疫苗。核酸疫苗 與傳統(tǒng)疫苗的最大差異在于所使用抗原類型的不同。傳統(tǒng)疫苗一般是滅活或減毒活 病原體，或病原體的亞單位蛋白。核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，直 接在宿主體細胞內(nèi)

28、完成表達和后加工，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白，提 呈給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過程相似。因此，核酸疫苗兼有重組亞單位疫苗的 安全性和減毒活疫苗誘導全方位免疫應(yīng)答的高效力。核酸疫苗可在機體內(nèi)不斷翻譯 表達，較長時間維持較高的蛋白水平，免疫具有連續(xù)性，一次接種可獲得長期或終 身免疫力。目前，對核酸疫苗的確切作用機制，以及接種人體的安全性等問題正在 繼續(xù)深入研究之中。（五） 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 （plant vaccine）轉(zhuǎn)基因植物疫苗，又稱植物疫苗，是指將有效免疫原編碼基因?qū)胫参锛毎?在其中表達和積累，人食用已表達目的抗原的轉(zhuǎn)基因植物后，可誘發(fā)宿主產(chǎn)生特異 性免疫應(yīng)答的新型疫苗。已嘗試用

29、于多種重組疫苗的研制，有一定的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn) 基因植物生產(chǎn)疫苗有兩種方法：一是建立穩(wěn)定的整合抗原基因的表達植株，并可通 過無性或有性繁殖生產(chǎn)大量的轉(zhuǎn)基因植物；二是建立瞬時表達植株，如用煙草花葉 病毒作為表達載體轉(zhuǎn)染植物細胞，目的抗原隨病毒在植物細胞內(nèi)復制增殖而得以高 效表達。（六） 治療性疫苗 （therapeutic vaccin早在20世紀初期，Wright等嘗試采用滅活疫苗治療慢性細菌性疾病，如葡萄 球菌性皮膚病和慢性淋病，取得較好的效果。但是，隨著抗生素的問世和迅速發(fā)展， 治療性疫苗用于傳染病治療的研究進入低潮。近年來，由于對病原微生物的致病機 制和機體抗感染免疫應(yīng)答的認識不斷加深，以及

30、耐藥菌感染日益嚴重，治療性疫苗 重新受到關(guān)注。預防性疫苗的接種對象是健康人群，一般為微生物的保護性抗原，成分較單純， 主要用于免疫預防作用，對機體無明顯的病理損傷，使用安全可靠，已在世界范圍 內(nèi)廣泛用于傳染病的預防接種。治療性疫苗的接種對象是持續(xù)性感染患者或帶菌者， 其組分不像預防性疫苗那樣單純，可根據(jù)需要進行組合和調(diào)整，如用微生物抗原基 因與不同細胞因子基因組成并表達的嵌合性疫苗。治療性疫苗旨在打破機體的免疫 耐受，提高對病原體特異性免疫應(yīng)答水平，故特別強調(diào)佐劑的選用。治療性疫苗可 用于慢性感染性疾病、腫瘤和過敏性疾病的治療。由于治療性疫苗屬于免疫治療， 可能伴有免疫損傷而有一定的不良反應(yīng)。

31、二、人工被動免疫當宿主已受感染，采用人工主動免疫已為時過晚，此時宜行人工被動免疫。人 工被動免疫是注射含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白、細胞因子或致敏 的免疫細胞等，使機體立即獲得特異性免疫，因而作用及時。但這些免疫物質(zhì)不是 患者自己產(chǎn)生的，故維持時間不長（表7-3）。（一） 抗毒素（an titox in）一般用細菌類毒素或外毒素多次免疫馬，待馬產(chǎn)生高效價抗毒素后采血，分離 出血清并提取其免疫球蛋白，精制成抗毒素制劑?？苟舅啬苤泻拖鄳?yīng)的外毒素，阻 斷其毒性作用。目前，我國的白喉、破傷風和肉毒中毒的抗毒素均用馬來制造，因 而使用這種異種抗毒素時，應(yīng)避免I型超敏反應(yīng)的發(fā)生。注射前務(wù)必先做

32、皮膚試驗, 必要時可采用脫敏療法。應(yīng)用人源性免疫球蛋白可避免發(fā)生超敏反應(yīng)。此外，外毒 素毒性強，與靶細胞的結(jié)合為不可逆的，故抗毒素只能中和游離的外毒素，用抗毒 素作人工被動免疫時，應(yīng)盡可能早期、足量注射。（二） 抗菌免疫血清（antibacterial immune serum）抗菌免疫血清是指用細菌免疫動物而制成的含有特異性抗體的血清。曾用于治療 肺炎鏈球菌、鼠疫耶氏菌、炭疽芽胞桿菌、百日咳鮑特菌等細菌感染性疾病。自磺 胺類和抗生素等抗菌藥物問世后，因抗菌免疫血清制備較繁、菌型又復雜，以及異 種血清可能引發(fā)超敏反應(yīng)等，目前已基本淘汰。只是某些多重耐藥菌（如銅綠假單 胞菌）感染時，仍可考慮抗菌

33、血清治療。（三）|免疫球蛋白（immunoglobulin）免疫球蛋白包括胎盤丙種球蛋白 (placetal gamma globulin)和血清丙種球蛋白(serum gamma globuli n)，前者是從健康產(chǎn)婦的胎盤和嬰兒臍帶血中提取而制成，后者是從正常成人血清中提取的。因大多數(shù)成人經(jīng)歷過多種常見致病菌的隱性感染 及疫苗接種，有的曾患過某些傳染病，故其血清中含有抗多種病原體的特異性抗體。 這種制劑源自人血清球蛋白，對患者雖有同種抗原問題存在，但由于免疫原性較弱,一般不會發(fā)生超敏反應(yīng)。免疫球蛋白主要用于麻疹、甲型肝炎、脊髓灰質(zhì)炎等病毒 性疾病的緊急預防，也可治療丙種球蛋白缺乏癥患者，以

34、及經(jīng)長期化療或放療的腫 瘤患者，以預防常見致病菌的感染。因這類制劑不是專門針對某一特定病原體的特 異性抗體，故其免疫效果不如高效價的特異性免疫球蛋白。（四）|細胞因子制劑（cytokine）參與細胞免疫的有關(guān)細胞和細胞因子較多，相互間的調(diào)控關(guān)系復雜。因此，細 胞因子制劑是近年來研制的新型免疫治療劑，但在抗細菌感染免疫中的應(yīng)用不多， 主要是用于一些病毒感染性疾病。常用的有 轉(zhuǎn)移因子(transfer factor, TF)、干擾素、IL-2等。第三節(jié) 細菌感染的治療1941年青霉素投入臨床使用，細菌感染性疾病的治療從此進入抗生素時代。到 了20世紀80年代，越來越多的細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性， 抗

35、菌治療面臨嚴重問題。 了解抗菌藥物的殺菌機制和細菌耐藥性的產(chǎn)生機制，有助于正確地使用抗菌藥物和 指導開發(fā)新型抗菌藥物，控制細菌耐藥性的產(chǎn)生和擴散。、抗菌藥物殺菌機制臨床應(yīng)用的抗菌藥物包括 抗生素(antibiotic)|和化學合成抗菌藥物?？股厥?某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的一類抗菌物質(zhì)，極微量即能選擇性地抑制或殺死某 些病原微生物。抗生素大多由放線菌和絲狀真菌產(chǎn)生。在抗生素母核中加入不同側(cè) 鏈或通過母核結(jié)構(gòu)改造而獲得的為半合成抗生素， 完全化學合成的為化學合成抗菌 藥物。 抗菌藥物的殺菌機制主要包括(圖7-1):I細胞壁合成|利福平細胞壁|葉馥代謝30S亞皋抑制刑，丸觀霉素1喘門庾存応|圖

36、 7-1 抗菌藥物作用靶位(一)阻礙細胞壁的形成肽聚糖是細菌細胞壁的主要組份。許多抗菌藥物能干擾肽聚糖的合成，使細菌 不能合成完整的細胞壁，可導致細菌死亡。其中糖肽類抗生素，如萬古霉素(vaneomycin)和替考拉寧(teicoplanin),可與UDP-胞壁酰五肽末端的D-Ala-D-Ala結(jié)合，形成復合物，可能抑制肽聚糖鏈延伸或肽鏈交聯(lián)；&內(nèi)酰胺類抗生素能與細垓酸會成犬環(huán)內(nèi)酯類菌競爭性抑制參與肽聚糖合成所需的轉(zhuǎn)肽酶和羧肽酶等，抑制四肽側(cè)鏈上D-Ala與 五肽交聯(lián)橋之間的聯(lián)結(jié)或側(cè)鏈直接相連。被伕內(nèi)酰胺類抑制的酶具有與青霉素結(jié)合的能力，故稱之為青霉素結(jié)合蛋白。3內(nèi)酰胺類抗生素含有一個

37、 伕內(nèi)酰胺環(huán)，主要種類有：青霉素類：如青霉素G(penicillin G)、甲氧西林(methicillin)、氨芐西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、 哌拉西林(piperacillin)等； 頭抱菌素類： 包括第一代如頭抱拉 定(cefradine)、第二代如頭抱克洛(cefaclor)、第三代如頭抱他啶(ceftazidime)、 頭抱曲松(ceftriaxone)和第四代如頭抱匹羅(cefpirome)頭抱菌素；單環(huán) 伕內(nèi) 酰胺類：如氨曲南(aztreonam);碳青霉烯類： 如亞胺培南(imipenem)、 比阿培 南(biapenem)； 頭霉素： 如

38、頭抱西丁(cefoxitin)、頭抱美唑(cefmetazo)。(二) 抑制蛋白質(zhì)的合成細菌核糖體由50S和30S亞基組成，許多抗菌藥物能干擾細菌核糖體的功能， 抑制蛋白質(zhì)合成，使細菌喪失生長繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，導致細菌死亡。主要種類有： 氨基糖苷類：如鏈霉素(streptomycin)、慶大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、地貝卡星(dibekacin)等，其殺菌機制主要 是與核糖體30S亞基不可逆地結(jié)合，將已接上的甲酰蛋氨酰-tRNA解離，抑制蛋白 質(zhì)合成起始過程；亦可阻止核糖體與釋放因子結(jié)合，阻斷蛋白質(zhì)的釋放；四環(huán)素 類：如四環(huán)素(

39、tetracycline)、多西環(huán)素(doxycycline)、替加環(huán)素(tigecycline)，可 特異性地與核糖體30S亞基A位結(jié)合，影響蛋白質(zhì)合成初始階段和釋放； 大環(huán)內(nèi) 酯類：女口紅霉素 (erythromycin)、螺旋霉素(spiramycin)、克拉霉素 (clarithromycin)、 阿齊霉素(azithromycin)，可與核糖體50S亞基結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)肽作用和mRNA位移，故而抑制蛋白質(zhì)合成；林可霉素(lincomycin)和克林霉素(clindamycin):抗菌 機制與大環(huán)內(nèi)酯類相似；氯霉素(chloramphenicol):可與核糖體50S亞基結(jié)合， 使肽鏈延伸受

40、阻。(三) 抑制核酸的合成主要藥物有：喹諾酮類：如諾氟沙星(norfloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、 氧氟沙星(ofloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin、等，通過與DNA解旋酶-DNA復 合體相結(jié)合，抑制DNA的斷裂-重接循環(huán)，干擾DNA雙螺旋形成，阻礙遺傳信息 的復制，發(fā)揮殺菌作用；利福霉素類：如利福平(rifampicin、利福布丁(rifabutin) 等，可與細菌的DNA依賴性RNA多聚酶3亞單位結(jié)合，抑制mRNA的合成； 磺胺類藥物：如磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SMZ)，通過阻斷核苷酸前體物質(zhì) 四氫葉酸的合成，抑制核酸的合

41、成；硝基咪唑類：如甲硝唑(metronidazole)，產(chǎn)生中介化合物，引起DNA鏈斷裂，干擾DNA復制。(四) 影響細胞膜的功能 細菌細胞膜具有選擇性屏障作用，并具有多種酶系統(tǒng)，參與生化代謝過程。多粘菌素(ploymycin、作用于革蘭陰性桿菌的磷脂，使細胞膜受損，細胞漿內(nèi)容物漏 出，引起細菌死亡。、細菌耐藥性細菌耐藥性(bacterial resista nc |可分為:固有耐藥(intrin sicresista nee):代代相傳的天然耐藥性；獲得性耐藥(acquired resista nee)是指致病菌因各種不 同原因?qū)咕幬锂a(chǎn)生了抵抗力，即由原來敏感變?yōu)椴幻舾校率汞熜Ы档突蛑?/p>

42、療 失敗。獲得性耐藥產(chǎn)生的分子機制有基因突變和耐藥基因轉(zhuǎn)移，后者可通過質(zhì)粒(plasmid)、轉(zhuǎn)座子(transposon)和整合子(integron)所介導。多重耐藥性 (multiple-drugresista nee MDR)是指細菌同時對多種作用機制不同(或結(jié)構(gòu)完全 各異)的抗菌藥物具有耐性。(一)臨床常見的耐藥菌1金黃色葡萄球菌20世紀50年代最早出現(xiàn)耐青霉素金黃色葡萄球菌。_隨著 耐酶青霉素和頭抱菌素的廣泛應(yīng)用，60年代出現(xiàn)|耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resista nt S.aureus MRSA)。目前MRSA檢出率占全部金黃色葡萄球菌 分離株的20%5

43、0%。 有些MRSA菌株對幾乎所有常用3內(nèi)酰胺類耐藥， 僅萬古霉 素有效。2002年，在美國發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(van comycin resista nt S.aureus VRSA)。2.革蘭陰性桿菌主要包括大腸埃希菌、肺炎克氏菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、不動桿菌、嗜麥芽黃單胞菌等，其中最為重要的是產(chǎn)超廣譜3-內(nèi)酰胺酶(extendedspectrum -(lactamase, ESBQ、AmpC酶(ampicillin cephamycinase,AmpC)、金屬3內(nèi)酰胺酶(metallo-(lactamase, MBL、和多重耐藥的菌株。ESBL能滅活青霉素類

44、、第一至第三代頭抱菌素和單環(huán)3內(nèi)酰胺類，僅對頭霉素和碳青霉烯類敏感。在重癥監(jiān)護病房(ICU)，革蘭陰性桿菌的耐藥性問題尤為突出。3.腸球菌1987年，在英國最先發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素腸球菌(va neomycin resista ntenterococcus, VREVRE常呈多重耐藥性，已在全球蔓延，暴發(fā)流行多發(fā)生在ICU， 患者病死率咼4.結(jié)核分枝桿菌多重耐藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB，通常指至少耐異煙肼和 利福平、檢出率高。隨著艾滋病的蔓延和流動人口的增加，多重耐藥結(jié)核分枝桿菌 的發(fā)生及傳播將更為嚴重。5.肺炎鏈球菌20世紀40年代，肺炎鏈球菌對最常用的青霉素高度敏感。70年代末發(fā)現(xiàn)高水平青霉素

45、耐藥株(pen icillin resista nt S.p neumo niae PRSP)。近年來，PRSP(包括中度敏感菌株、檢出率呈明顯上升趨勢，在多個國家已超過10%，6.流感嗜血桿菌20世紀70年代初，氨芐西林取代氯霉素和四環(huán)素成為治療 流感嗜血桿菌感染的首選藥物。近20多年來，氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌檢出率逐 年增加，遍布全球。7淋病奈瑟菌 青霉素一直是治療淋病的首選藥物，但到20世紀70年代中期，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)青霉素酶的淋病奈瑟菌(penicillinase-producing N.gonorrhoeae, PPNG)。80年代又出現(xiàn)不產(chǎn)青霉素酶的染色體介導的青霉素和四環(huán)素耐藥菌株。P

46、PNG流行率最高的是東南亞。由于淋病奈瑟菌對青霉素和四環(huán)素出現(xiàn)耐藥性，使得在治療不復 雜的淋病時不得不選用廣譜頭抱菌素和諾氟沙星等。8.志賀菌屬1959年在日本發(fā)現(xiàn)多重耐藥痢疾志賀菌感染暴發(fā)。1990年，布隆迪暴發(fā)流行的痢疾志賀菌對該國所有口服抗生素均呈耐藥。志賀菌對以前常用的呋喃唑酮、慶大霉素、氨芐西林、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率呈逐年上升趨勢。（二）耐藥的生化機制細菌對某一抗菌藥物可能存在多種耐藥機制。1滅活作用 這是細菌產(chǎn)生耐藥性的最重要方式。 細菌被誘導產(chǎn)生滅活酶， 通 過修飾或水解作用破壞抗生素，使之轉(zhuǎn)化為無活性的衍生物。常見的滅活酶有伕內(nèi)酰胺酶、超廣譜&內(nèi)酰胺酶、

47、氨基糖苷類修飾酶（乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷 酸轉(zhuǎn)移酶）、紅霉素酯酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等。 &內(nèi)酰胺酶可破壞&內(nèi)酰胺環(huán)而使3內(nèi)酰胺類的活性失去或減低，這是大多數(shù)致病菌耐禺內(nèi)酰胺類的主要機制。氨基糖苷類修飾酶能將氨基糖苷類抗生素的游離氨基乙酰化，將游離羥基磷酸化、核苷 化，使藥物不易進入菌體內(nèi)，也不易與細菌內(nèi)靶位-核糖體30S亞基結(jié)合，從而失去 抑制蛋白質(zhì)合成的能力。2靶位改變 細菌通過產(chǎn)生誘導酶對抗生素的作用靶位進行化學修飾， 或通過 基因突變造成靶位改變， 使抗菌藥物不能與靶位結(jié)合或親和力下降， 失去殺菌作用。 例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）能產(chǎn)生一種新的青霉素結(jié)

48、合蛋白PBP2（或PBP2a）,對所有3內(nèi)酰胺類具有低親和性。在3內(nèi)酰胺類抗生素存在的條件 下，雖然該菌正常的5種PBP被抑制，不能發(fā)揮正常生理功能， 但PBB-2/不被抑 制， 可作為轉(zhuǎn)肽酶等完成細胞壁的合成， 故該菌對3-內(nèi)酰胺類從敏感轉(zhuǎn)呈耐藥。又 如核糖體30S亞基S12蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，鏈霉素失去結(jié)合受體而不能發(fā)揮抑菌作 用。3減少藥物吸收 由于細胞壁的有效屏障或細胞膜通透性的改變， 阻止藥物吸 收，使抗生素難以或無法進入菌體內(nèi)發(fā)揮作用。例如分枝桿菌的細胞壁存在異常緊 密的結(jié)構(gòu)，通透性極低；銅綠假單胞菌外膜上由孔蛋白構(gòu)成的蛋白通道較特殊，通 透能力比大腸埃希菌低1 00多倍，加之生物膜

49、的形成而使抗菌藥物不易進入菌體內(nèi)， 故分枝桿菌和銅綠假單胞菌對眾多的抗菌藥物呈現(xiàn)明顯的多重耐藥性。此外，在接 觸抗生素后，細菌可改變外膜孔蛋白的組成、關(guān)閉孔蛋白或減少其數(shù)量（如OmpF和OmpC的表達減少），降低外膜通透性，產(chǎn)生耐藥性。例如，鼠傷寒沙門菌因缺 乏蛋白通道而產(chǎn)生多重耐藥性。4增加藥物排出 細菌具有能量依賴性的主動外排系統(tǒng)， 可將不同種類的抗生 素同時泵出體外，使菌體內(nèi)的抗生素濃度明顯降低，不足以殺死細菌。這是細菌產(chǎn) 生多重耐藥性的主要原因。主動外排系統(tǒng)通常由外排轉(zhuǎn)運蛋白、外膜通道蛋白和連 接蛋白（或輔助蛋白）組成。（三）抗菌藥物應(yīng)用與耐藥性的產(chǎn)生細菌可通過基因突變或 “耐藥基因

50、”轉(zhuǎn)移而成為耐藥菌株，但耐藥菌株在菌群中 僅占極少部分，在自然環(huán)境下難以與占有壓倒優(yōu)勢的敏感菌競爭，其生長規(guī)模必然 受到正常菌群的拮抗。然而，抗生素的廣泛應(yīng)用提供了對耐藥突變株的選擇環(huán)境。例如當給患者長期使用抗生素，尤其是廣譜抗生素時，正常菌群中敏感菌株將迅速 被抑制或“淘汰”，使得患者對醫(yī)院流行的耐藥菌株變得更加易感， 耐藥菌株乘機侵 入并大量繁殖成為新的優(yōu)勢菌，最終取代敏感菌株的地位?？梢?，抗生素在耐藥菌 產(chǎn)生過程中起到篩選作用。細菌耐藥性的產(chǎn)生與變遷與臨床上抗生素廣泛或過度應(yīng)用有絕對關(guān)系。醫(yī)院是 抗生素使用集中的地方， 醫(yī)院內(nèi)的細菌耐藥檢出率明顯高于社區(qū)。 對于同一種細菌， 醫(yī)院內(nèi)分離株耐藥性較強和較廣