超聲波提取杠板歸多糖的工藝研究

1、R917 貴州醫(yī)科大學(xué)12屆藥學(xué)專業(yè)本科畢業(yè)論文超聲波提取杠板歸多糖的工藝研究 學(xué) 生： 黃韻蓓 學(xué) 號： 20120401107 年 級： 12 級 專 業(yè)： 藥 學(xué) 指導(dǎo)教師： 王曉麗教授 實習(xí)單位：貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室2016年 4 月 7 日目 錄 摘 要 1 前 言 2 材料與方法 2 結(jié)果與分析 5 討 論 10 參考文獻(xiàn) 12 致 謝 13超聲波提取杠板歸多糖的工藝研究學(xué)生：黃韻蓓 導(dǎo)師：王曉麗教授摘要：目的 從杠板歸中提取多糖，并測定其含量計算收得率，為杠板歸質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供科學(xué)根據(jù)。方法 在單因素考察提取杠板歸多糖的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計法；以杠板歸藥材多糖含量為

2、指標(biāo)，用超聲波輔助提取，醇沉法得到多糖沉淀，用高濃度醇清洗沉淀，加蒸餾水溶解，采用苯酚硫酸法在490nm處測定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，計算杠板歸多糖的提取率，確定最佳提取工藝。結(jié)果 研究3個較顯著因素，液料比、提取溫度、提取時間對杠板歸多糖提取率的影響；在此基礎(chǔ)上，用正交試驗法確定了杠板歸多糖最佳提取工藝為：料液比1:10，提取溫度80，提取時間30min，最高提取率為3.34%。結(jié)論 優(yōu)化的提取工藝提取多糖效果好，穩(wěn)定可行，對杠板歸多糖的進(jìn)一步研究和杠板歸藥材的質(zhì)量評價具有科學(xué)的參考價值。關(guān)鍵詞：超聲波；多糖；工藝優(yōu)化Ultrasonic extraction bar plate t

3、echnology research of polysaccharidesAbstract：Purpose To extract polysaccharide from poles board, and the determination of its content rate calculation, bar plate to provide a scientific basis for quality control, and resource development.Method Polysaccharide extraction bar plate to the single fact

4、or investigation, on the basis of orthogonal experiment design method; Herbs polysaccharides content as an index, with bar plate by ultrasonic assisted extraction, alcohol heavy precipitation method for polysaccharide, clean with high concentration of alcohol precipitation, add distilled water to di

5、ssolve, using the phenol - sulfuric acid method determination of absorbance at 490 nm, with glucose standard as reference substance, extraction yield of polysaccharide in bar plate to determine the optimal extraction process.Result Research three significant factors, liquid ratio, extraction tempera

6、ture and extraction time on the bar plate to the influence of the polysaccharide extraction yield; On this basis, the poles are determined by using orthogonal test plate for polysaccharide extraction process is: the best material liquid than 1:10, extraction temperature 80 , extracting time 30 min,

7、the highest ratio of 3.34% .Conclusion To optimize the extraction technology to extract polysaccharide effect is good, stable work, the experiment of bar plate polysaccharide and poles for the further study of the board for the quality of medicinal materials evaluation provides a reliable experiment

8、al basis.Key Words：ultrasonic；polysaccharide；Process optimization1.前言 杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸Poly gonum perfoliatum L.的干燥地上部分，又名蛇倒退，穿葉蓼等。原收載于貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“1”，現(xiàn)為中國藥典2010版新增品種。目前，藥典2015版“2”并未規(guī)定杠板歸多糖的含量測定，本文對杠板歸多糖的提取方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，通過計算多糖收得率選出最優(yōu)提取工藝，有利于杠板歸藥材資源的保護(hù)和開發(fā)利用。 據(jù)中藥大辭典記載，杠板歸全草入藥，具備清熱解毒、殺蟲止癢、祛風(fēng)止咳、利水消腫的功效，民間普遍用于

9、治療水腫尿少，咽喉腫痛，瘧疾，痢疾，小兒頓咳，潰瘍，濕疹，皰疹，疥廯及蛇蟲咬傷等，療效顯著“3-4”。該植物含有豐富的生物活性物質(zhì)，主要有黃酮、酚類、生物堿、有機(jī)酸、糖類等“5-6”。多糖是由多個單糖基及糖苷鍵相連而成的高聚物，一般是10個單糖通過苷鍵方式連接而成，廣泛存在于動物細(xì)胞膜、高等植物和微生物的細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，同維持生命活動密切相關(guān)“7-8”，多糖近年來被發(fā)現(xiàn)能有效清除人體內(nèi)的氧自由基，極高機(jī)體的免疫功能，并具有抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗?jié)兊榷喾N生物功能，且無毒副作用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品等領(lǐng)域，作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品，具有廣闊的市場前景“9-10”。杠

10、板歸為中國藥典2010版新增品種，在我省資源非常豐富，若能夠全面開發(fā)利用，前景非常可觀。目前關(guān)于杠板歸多糖的研究甚少，本文首次采用超聲波輔助法提取杠板歸多糖，并采用正交實驗研究出最佳提取工藝，為杠板歸資源的開發(fā)與利用提供實驗和理論依據(jù)。2.材料與方法： 2.1材料:杠板歸采于貴州省黔東南州榕江縣，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王曉麗教授鑒定為杠板歸（Poly gonum perfoliatum L.），除雜切斷，于60干燥箱中烘干，粉碎（過四號篩），放于干燥器中備用。 主要試劑: 98%硫酸（重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）、苯酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、95%乙醇（重慶川東化工（集團(tuán)）有限

11、公司），均為分析純，水為蒸餾水，D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201205）。 主要儀器與設(shè)備：TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)，UV-5800PC型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），BS223S電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,101-1-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），AS系列超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），F(xiàn)W135中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。 2.2試驗方法 2.2.1供試品溶液的制備：精密稱取杠板歸粉末1g于50ml具塞錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，在120W超聲波清洗儀中超聲

12、提取，然后用循環(huán)水式多用真空泵進(jìn)行抽濾得濾液，取濾液1ml加 95%的乙醇溶液 2 ml，放置24 h，將樣品溶液放入高速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為3600 r·min1，離心10 min，棄清液，用95% 的乙醇清洗沉淀，取沉淀于10ml容量瓶中加入適當(dāng)蒸餾水溶解并定容“11”。 2.2.2對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的D-葡萄糖對照品5mg，置于10ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，搖勻，制成濃度為0.5mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。 2.2.3顯色劑的配制：精密稱取分析純苯酚80g加蒸餾水20g使之溶解，搖勻置棕色瓶中，放置4冰箱長期儲存，備用。臨用前用80%苯酚溶液加蒸餾水稀釋成5%

13、苯酚溶液，用于實驗。 2.2.4測定波長的確定：精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于10ml具塞試管中，加入1ml5%苯酚溶液，搖勻，加入5ml98%硫酸溶液，搖勻后常溫靜置10min，后40ºC水浴15min，取出后靜置至室溫“12”，在190600nm波長范圍內(nèi)用紫外分光光度計全波長掃描，選擇最大吸收波長作為杠板歸多糖的吸收波長進(jìn)行測定。 2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml對照品溶液于6只10ml具塞試管中，加蒸餾水至2ml，加入1ml5%苯酚溶液，搖勻，加入5ml98%硫酸溶液，搖勻后常溫靜置10min，后40ºC水浴1

14、5min，取出后靜置至室溫，在波長490nm處測定吸光度。精密量取蒸餾水2ml同上述操作作空白，然后在波長490 nm處測定吸光度，以吸光度 (A) 為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。 2.2.6精密度試驗：精密量取同一葡萄糖對照品溶液，按照“2.2.3”項方法測定吸光度，重復(fù)測定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到葡萄糖的含量，計算RSD值。 2.2.7重復(fù)性試驗：取同一杠板歸樣品，按照“2.2.1”項方法制備供試液5份，按照“2.2.5”項方法測定吸光度，計算RSD值。 2.2.8穩(wěn)定性試驗：取同一供試液，分別于0，2，4，6，8，12，24h按照“2.2.5”項方法測定吸光度，計

15、算RSD值。 2.2.9加樣回收率試驗：精密量取適量供試液5份，分別加入不同量對照品溶液，按照“2.2.3”項方法依法測定吸光度，計算平均回收率和RSD值。 2.2.10測定法：稱取藥材適量按照供試品方法制備，分別量取1ml供試品溶液于10ml具塞試管，加入1ml5%苯酚溶液，搖勻，加入5ml98%硫酸溶液，搖勻后常溫靜置10min，后40ºC水浴15min，取出后靜置至室溫，在波長490nm處測定吸光度。 2.2.11杠板歸多糖得率的計算： 精密量取供試液1ml按“2.2.5”項測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算供試液濃度，根據(jù)下列公式計算多糖得率。 多糖得率（%）=C ×

16、 V × D/W × 100% 其中：C為被測液濃度（mg/ml），D為稀釋倍數(shù)；V為總體積（ml）；W為原料質(zhì)量（mg）。 2.3單因素實驗設(shè)計 2.3.1料液比對多糖提取率的影響：精密稱取1g杠板歸粉末5份，分別設(shè)置料液比為1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，在70，超聲功率為120W的超聲波清洗儀中超聲20min，按“2.2.1”項所述方法抽濾，離心，清洗沉淀，將沉淀稀釋至10ml得樣液，取1ml按照“2.2.9”項測定杠板歸多糖含量，計算提取率，研究不同的料液比對多糖提取率的影響。 2.3.2提取時間對多糖提取率的影響：精密稱取1g杠板歸粉末5份，放入

17、錐形瓶中，按照1:20的料液比加入蒸餾水，分別設(shè)定超聲時間為10min、15min、20min、25min、30min，在70，超聲功率為120W的超聲波清洗儀中超聲提取，按“2.2.1”項所述方法抽濾，離心，清洗沉淀，將沉淀稀釋至10ml得樣液，取1ml按照“2.2.9”項測定杠板歸多糖含量，研究不同的提取時間對多糖提取率的影響。 2.3.3提取溫度對多糖提取率的影響：精密稱取1g杠板歸粉末5份，放入錐形瓶中，按照1:20得料液比加入蒸餾水配制溶液，分別設(shè)定提取溫度為60、65、70、75、80，在120W的超聲波清洗儀中超聲20min，按“2.2.1”項所述方法抽濾，離心，清洗沉淀，將沉淀

18、稀釋至10ml得樣液，取1ml按照“2.2.9”項測定杠板歸多糖含量，計算提取率，研究不同的提取溫度對多糖提取率的影響。 2.3.4超聲強(qiáng)化提取杠板歸多糖的正交實驗設(shè)計本實驗以杠板歸多糖得率為主要指標(biāo)，選取料液比（A），提取時間（B），提取溫度（C）3個影響因素，各自設(shè)定5水平進(jìn)行正交實驗，因素水平表見表1。表1 正交試驗設(shè)計因素表水平提 取 因 素料液比A提取時間B/min提取溫度/11:10106021:15156531:20207041:25257551:303080 2.3.5 數(shù)據(jù)處理：獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次實驗，結(jié)果表示3次測定的平均值。3. 結(jié)果與分析 3.1試驗測定結(jié)果的分析 3.1

19、.1測定波長選擇：由圖1可知，在190600nm波長范圍內(nèi)用紫外分光光度計全波長掃描，測定最大吸收波長為490nm，見圖1。圖1 標(biāo)準(zhǔn)品紫外分光光度波譜圖圖2 樣品紫外分光光度波譜圖 3.1.2線性關(guān)系考察：以濃度C對吸光度A作線形圖，得葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.5407x+0.0288（R2=0.9912)，如圖3所示.結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)硫酸-苯酚法顯色后在0.05mg/ml0.3mg/ml范圍線性關(guān)系良好。圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 3.1.3精密度試驗：精密量取對照品溶液1ml，置于10ml具塞試管中，按照“2.2.4”項方法，連續(xù)進(jìn)行5次測定吸光度值，計算RSD=0.047，

20、該結(jié)果表明儀器的精密度良好。 3.1.4重復(fù)性試驗：精密稱取杠板歸粉末1g，共5份，按照“2.2.1”項方法制備供試液，再按照“2.2.10”項方法測定吸光度值，計算RSD=0.071，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。 3.1.5穩(wěn)定性試驗：精密稱取杠板歸粉末1g，按照“2.2.1”項方法制備供試液，于0,2,4,6,8,12,24h按照“2.2.10”項方法測定吸光度，計算RSD值=0.11，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。 3.1.6加樣回收率試驗：精密稱取杠板歸粉末1g，按照“2.2.1”項方法制備供試液，精密量取0.25ml供試液5份，分別加入不同量對照品溶液，用蒸餾水稀釋至2ml,按照“2

21、.2.10”項方法測定吸光度值，求得平均回收率=99.3%，RSD=1.02,結(jié)果表明該方法回收率良好，所制定分析方法的準(zhǔn)確度高。 3.2料液比的影響 由圖4可知，杠板歸多糖的提取率隨著料液比的增加而逐漸減小，當(dāng)料液比超過1:15時，提取率的下降趨勢趨于平緩。這主要是因為隨著水的加入量增多，超過一定比例后，則促進(jìn)杠板歸多糖的水解作用，使得杠板歸多糖的提取率急劇下降，促進(jìn)提取的作用也不再明顯，從而使整體提取率趨于穩(wěn)定。但由于于超聲提取的杠板歸為干燥粉末，料液比過小也不利于杠板歸粉末與溶液充分接觸，提取溶液過少極易損失，從而使提取誤差增大。因此，料液比控制在1:10為宜。圖4 料液比對多糖得率的影

22、響 3.3提取溫度的影響 由圖 5可知，升溫有利于提高多糖得率，隨著提取溫度的提高，杠板歸多糖的提取率不斷提高 ,在溫度達(dá)到70時達(dá)到最大，隨后隨著溫度的升高提取率緩慢下降。因此可以看出杠板歸多糖在溶劑中具有一定的溶解度，多糖易溶于熱水，溫度過小，提取不完全；而提取溫度過高，可能會破壞多糖的糖苷鍵，使多糖發(fā)生降解而影響其生物活性；也可能由于過高的溫度下，性質(zhì)遭到破壞的多糖，經(jīng)苯酚濃硫酸作用不易被檢測，因此導(dǎo)致多糖的提取率降低，故提取溫度控制在70為宜。圖5 提取溫度對多糖得率的影響 3.4提取時間的影響 由圖6可知，提取時間越長越有利于杠板歸多糖的提取，但當(dāng)提取時間超過15min以后，多糖提取

23、率趨于穩(wěn)定，基本保持同一水平。提取時間15min30min的提取率基本一致，考慮到提取時間過長會延長生產(chǎn)周期，在保證提取效果的同時盡量節(jié)省時間，因此提取時間控制在15min為宜。圖6 提取時間對多糖得率的影響 3.5多因素的影響由于提取率實際上是受料液比、提取時間、提取溫度三個因素交叉影響，為了全面考察這三個因素的影響，設(shè)計了三因素五水平正交試驗對杠板歸多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過正交試驗結(jié)果以確定各因素對提取率的影響程度，結(jié)果詳見表2。對表實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行極差R分析可知，料液比A對多糖提取率的影響最大，其次是提取時間B，提取溫度C影響相對較小。因此，各因素對多糖提取率的影響大小為：料液比&

24、gt;提取時間>提取溫度。根據(jù)上述結(jié)果確定提取杠板歸多糖的最佳參數(shù)為：料液比1:10，超聲時間30min,超聲溫度80。在此條件下，杠板歸多糖的提取率為3.34%。表2 正交試驗結(jié)果實驗號ABC吸光度A得率%11110.4942.9421220.4372.6531330.3762.3241440.4322.6251550.5663.3462120.2441.6072230.3492.1782340.3322.0792450.3121.97102510.2771.78113130.2341.53123240.2631.70133350.2481.63143410.2621.70153520

25、.2631.70164150.1851.28174210.1771.24184320.1941.33194430.2211.48204540.2011.37215150.1581.14225210.1601.15235320.1691.20245430.1871.29255540.1671.19K12.771.701.78K21.921.781.73K31.651.711.74K41.341.811.77K51.191.881.86R1.580.180.134. 討論 植物都有細(xì)胞壁，多糖的提取需要依靠滲透壓的作用壓的作用從組織細(xì)胞內(nèi)穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁才能溶解釋放出來，而傳統(tǒng)的處理方法卻難以達(dá)

26、到破碎細(xì)胞破壁的程度，多糖的分子量又都比較大，故提取效果不佳，造成資源利用率低、提取時間長、能耗高、有效成分損失嚴(yán)重。 水提醇沉法是目前較為常見的多糖提取方法，利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用高濃度乙醇沉淀提純多糖，其試驗設(shè)備簡單，工藝成本低、操作容易，準(zhǔn)確度高，適于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，是一種可取的多糖提取方法“14”。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法是常用的多糖含量測定方法。研究表明，苯酚-硫酸法方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響較穩(wěn)定，是較理想的多糖含量測定方法；而蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性較差，線性關(guān)系不理想，重復(fù)性、穩(wěn)定性所測數(shù)據(jù)差異較大“15”。因此，本實驗中采用苯酚-硫酸法測定杠

27、板歸藥材的多糖含量。本實驗首次采用超聲波浸提法，提取杠板歸藥材中的多糖，設(shè)計了三個提取因素（本來是設(shè)計了四個提取因素：包括料液比、提取時間、提取功率和提取溫度，但由于實驗室條件限制，只能舍去提取功率這一因素），并采用正交實驗的出最佳提取工藝，實驗結(jié)果表明提取率高，結(jié)果證實可靠，所受外界因素干擾少；所用方法快速簡便、高效低能、靈敏度高、不需要精密儀器；用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量，使測得多糖含量不受蛋白質(zhì)影響，結(jié)果更加精確。所用到試劑少且安全、低毒、價格低廉。提取效果好，正交實驗的出最佳提取工藝為料液比1:10，超聲時間30min,超聲溫度80。在此條件下，杠板歸多糖的提取率為3.34%，比水浸

28、提法高出兩倍，實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可為杠板歸多糖的定量分析及質(zhì)量評價控制提供了科學(xué)依據(jù)。多糖是杠板歸藥材重要活性成分之一，具有多方面的生物功能和良好的臨床效果，本實驗研究了提取杠板歸多糖的最佳工藝，多糖含量可作為杠板歸藥材質(zhì)量評級的指標(biāo)之一?，F(xiàn)在還沒有關(guān)于超聲波提取杠板歸多糖工藝優(yōu)化的文獻(xiàn)，因此，研究優(yōu)化杠板歸多糖的提取條件有重要意義，可為杠板歸藥材的質(zhì)量控制與評價提供實驗依據(jù)。 參考文獻(xiàn)1貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)S.貴陽：貴州科技出版社，2003:198.2國家藥典委員會.中國藥典（2015年版）M.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.3瞿自明，徐方舟，獸醫(yī)中草藥大全M.北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1996:396.4江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）M.上海：上海科技技術(shù)出版社，2000:869-871.5 趙超，陳華國，龔小見，等，杠板歸的化學(xué)成分研究（）J.中草藥，2010,41（3）:365-367，6李紅芳，趙有興，劉玉清