ChIP、RIP、RNApull-down、EMSA、Luciferase原理

1、1 ChIP實驗      通過與染色質(zhì)片段共沉淀和PCR技術(shù)，在體內(nèi)檢測與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段。將處于適當(dāng)生長時期的活細胞用甲醛交聯(lián)后將細胞裂解, 染色體分離并打碎為一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特異性抗體免疫沉淀目標(biāo)蛋白與 DNA交聯(lián)的復(fù)合物, 對特定靶蛋白與DNA片段進行富集。采用低pH值條件反交聯(lián), DNA與蛋白質(zhì)之間的 Schiff鍵水解, 釋放DNA片段。通過對目標(biāo)片段的純化與檢測,獲得DNA與蛋白質(zhì)相互作用的序列信息。圖2  ChIP實驗流程      2 RIP實驗  

2、0;   RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行分析；即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具

3、，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。圖3  RIP實驗流程 3 RNA pull-down實驗      使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。 圖4  RNA pull-down實驗流程       4 EMSA實驗      凝膠遷移或電泳遷移

4、率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。圖5  EMSA實驗原理 5 Luciferase實驗      熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應(yīng)。      螢光生成反應(yīng)

5、通常分為以下兩步：      螢光素+ ATP 螢光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+ PPi      螢光素化腺苷酸+ O2 氧螢光素+ AMP +光      熒光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉(zhuǎn)染到細胞中，將不同類型的細胞（骨髓干細胞、T細胞等）標(biāo)記上（即表達）熒光素酶，就可以用高敏感度的CCD相機進行對動物體內(nèi)進行活體觀察而不會傷害到動物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光，而發(fā)出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測器或改進后的光學(xué)顯微鏡探測到。這就使得

6、對包括感染在內(nèi)的多種生命活動進程進行觀察成為可能。 圖6  Luciferase研究增強子原理  圖7 Luciferase常用載體 圖8  Luciferase片段缺失分析實驗流程圖9  Luciferase定點突變分析實驗流程      熒光素酶分析可應(yīng)用于啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、藥物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測、活細胞的實時動態(tài)研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析、難轉(zhuǎn)染的細胞（包括干細胞和原代細胞）的研究、RNA剪接研究。      雙熒光素酶報告基因測試，是結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術(shù)。在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時，通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng),結(jié)合pRL載體系統(tǒng)，表達第二個報告基因海洋腔