青花菜MYB28、MYB29基因克隆與功能分析

1、青花菜MYB28 MYB2喔因克隆與功能分析脂肪族芥子油昔(aliphatic glucosinolates,AGSL)!一種廣泛存在于十字花科植物中的含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物, 其降解產(chǎn)物( 如蘿卜硫素) 不僅在植物防御、響應(yīng)生物或非生物脅迫的生理過(guò)程中具有重要的作用, 而且還具有極強(qiáng)的抗癌活性。MYB2舜口 MYB2用調(diào)控脂肪族GSLf£物合成的兩類重要轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥中MYB2和MYB29ft接調(diào)控脂肪族芥子油昔的合成。在十字花科蔬菜中 , 青花菜中的芥子油苷含量最為豐富, 成分更為復(fù)雜, 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)青花菜AGS民物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因研究的較多，而對(duì)其中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)

2、錄因子的研究則相對(duì)較為滯后。本研究以高蘿卜硫素青花菜“福青 1號(hào)”為材料，克隆了 MYB28B MYB2的 種轉(zhuǎn)錄因子, 并對(duì)其表達(dá)模式以及功能進(jìn)行初步了分析, 主要研究結(jié)果如下：(1)通過(guò)同源克隆的方法，克隆出青花菜脂肪族芥子油昔合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB28勺2個(gè)同源基因(BoMYB28-1, BoMYB28-2和 MYB29勺2個(gè)同源基因(BoMYB29-1和 BOMYB29-2)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子核甘酸序列與其他物種同類 基因的同源性較高，均含有明顯的MY琛族R2R州轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，初步確定它們 為青花菜 BoMYB28口 BoMYB29fig|。上述四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子提交至 Ge

3、nBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為：KM262765.1、KM262766.1、 KM262767.1 和 KM262768.1。 (2)分別構(gòu)建了BoMYB28-1,BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2S因的亞細(xì)月fi定位載體，并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示在洋蔥表皮細(xì)胞核中均出現(xiàn)明顯的綠色熒光, 表明 BoMYB28-1,BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2S因定位于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子基因。(3)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，四個(gè)同源基因在青花菜不同組織中基因的表達(dá)量存在顯著差異。其中BoMYB28-lfc花球中表達(dá)量最高，約是根中的100倍, 隨著莖、葉和

4、花逐漸降低。在種子中BoMYB28-1的表達(dá)量幾乎檢測(cè)不到。BoMYB28-2S因在莖中表達(dá)最高 , 較根中的表達(dá)量略高。花球和花中的表達(dá)量略少于根, 在葉中的表達(dá)量很少, 種子中幾乎見(jiàn)不到表達(dá)。BOMYB29-1S因的表達(dá)量在花球中的最高，約是根中表達(dá)量的6倍，莖和葉中的表達(dá)量相似, 略低于花球, 在種子中的表達(dá)量較根略高。BoMYB29-2S因的表達(dá)在花球中的表達(dá)量最高,大約是根中的3倍，在莖中的表達(dá)量較花球中略低, 隨著葉、 根和花逐漸降低, 在種子中幾乎檢測(cè)不到基因的表達(dá)量。用MeJ所口蔗糖對(duì)青花菜進(jìn)行脅迫處理分析發(fā)現(xiàn)，四個(gè)同源基因的表達(dá)量隨著處理的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加, 并分別在15 m

5、in 和 2 h 時(shí)達(dá)到最高, 隨后表達(dá)量逐漸降低至初始狀態(tài)。(4) 構(gòu)建了四個(gè)同源基因的過(guò)量表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中, 分別獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 隨著轉(zhuǎn)錄因子BoMYB28-1.BOMYB28-2.BoMYB29-體口 BoMYB29.2S因表達(dá)量的增加，脂肪族芥子油昔的含量有了顯著改變。其中，在BoMYB2&1和BoMYB28-2t表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中，短鏈脂肪族芥子油苷的含量顯著增加, 而長(zhǎng)鏈脂肪族芥子油苷的含量未有明顯的改變。在BoMYB29 1 和 BoMYB2 9 2過(guò)表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中, 短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪族芥子油苷含量均有顯著增加。(5)構(gòu)建了 BoMYB28口