飼料原料中赭曲霉毒素的快速篩查膠體金快速定量法

1、飼料原料中赭曲霉毒素的快速篩查膠體金快速定量法江西省地址標準編制說明一、標準制定意義（一）介紹赭曲帶毒素A是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等）、 花生、蔬菜（豆類）等農作物上的曲霉和青霸產生的。動物攝入霉變飼料后，這種毒素也可 能出此刻豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素要緊損害動物肝贓與腎臟，引發(fā)肝臟和腎臟損傷， 大量毒素也可能引發(fā)動物腸黏膜炎癥和壞死。有報導指出，食物中的OTA與一種致命的地址 性腎臟疾?。╞alkanendemicnephropathy）有關，且有致癌、致畸作用，最近幾年來引發(fā)了 人類營養(yǎng)學家的重視。正常條件下，小麥和玉米受0TA污染的機率較小，約設5

2、樂其含 量為5mg/kg：大麥和燕麥被污染的機率較高，約為10%,其含量一樣在kg以下，個別樣 品高達27mg/'kgo赭曲霉毒素包括3種類型，毒性強弱順序是：0TA>0TC>0TBo OTB是OTA的脫氯衍生物, OTC是0TA的乙基酯，OTB和OTC的含量一樣較低，毒性較0TA小。因此，飼料檢測時能夠 要緊分析OTA含量。目前，小麥、大麥、玉米等谷類作物中OTA的測定方式有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免 疫吸附法（ELISA）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質譜法 （HPLC-MS） . TLC法繁瑣費時，且靈敏度、特異性較差，提取進程中所

3、需有機溶劑品種多 且量大，易污染環(huán)境，對人體有較大危害。ELISA法測定結果受試劑盒不同、實驗溫度、儀 器靈敏度等條件阻礙較大。GC、GC-MS. HPLC和HPLC-MS法普遍存在著樣品前處置進程復雜, 靈敏度易受樣品的凈化、濃縮等步驟的阻礙，耗時，檢測設備昂貴，并要求有專業(yè)的技術人 員及較長的分析周期。同時，這些檢測方式無一例外要求在檢測進程中利用毒素標準溶液， 給環(huán)境和檢測人員的平安造成風險。本標準項目是通過化學合成法制備赭曲霉毒素A人工抗 原，利用此抗原免疫實驗動物制備赭曲霉毒素A單克隆抗體，基于此原料基礎上開發(fā)赭曲霉 毒素A快速檢測試紙條，再通過膠體金讀數儀進行大米、玉米、小麥等樣品

4、中赭曲客毒素的 定量分析。定量分析便于將檢測結果與國家限量對照，有助于監(jiān)管部門依照糧食的污染水平 進行糧食分級治理，同時有助于企業(yè)內部更好地進行質量操縱。本標準可提高糧食樣品檢測、 監(jiān)測效率，降低本錢，愛惜環(huán)境，保障從業(yè)人員健康平安。（二）背景據聯(lián)合國糧農組織（FAO）統(tǒng)計，全世界每一年谷物產量的25舟受到真菌毒素不同程度 的污染。隨著飼料工業(yè)的快速進展，最近幾年來，中國的飼料也受到帶菌污染的嚴峻挑戰(zhàn)。 自2006年以來，玉米等飼料原料價錢普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶利用低質飼料 原料，加上最近幾年來氣候的轉變，華北、東北地域降雨量增加，進一步加重了飼料原料中 真菌毒素的污染。而由于飼料

5、原料和配合飼料中多種真菌毒素同時存在，在食用油等產品及 牛奶中真菌毒素污染也比較嚴峻?；钪缭S多地址，目前真菌毒素已組成重要的食物平安問 題。真菌毒素對人類和動物健康可產生嚴峻的阻礙，這一熟悉致使了許多國家在近幾十年來 制定了諸多有關食物和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以愛惜人類的健康，并保障生產者和貿易商 的經濟利益。隨著全世界經濟一體化的進程,類似真菌毒素等涉及平安衛(wèi)生項目的限量標準, 愈來愈多地被利用為貿易愛惜主義中非關稅壁壘的重要手腕。因此，為了保證食物平安，保 障消費者的健康，為了打破國外的技術壁壘，同時在合理有利的前提下，更多地樹立我國的 技術性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并成立標準方式

6、是有效的方式之一。目前國內應用 標準檢測方式大多為儀器方式，所需儀器設備昂貴，無益于進行普遍推行，而且限制了很多 檢測單位高效、普遍地開展檢測工作。成立符合中國國情的快速檢測方式標準，具有檢測快 速、簡便、靈敏、本錢低等優(yōu)勢，為打開市場并占據市場提供了先決條件。（三）限量標準、檢測方式及研究現(xiàn)狀一、限量標準世界各國均對食物中赭曲帶毒素A的含量做出了嚴格的規(guī)定。歐盟關于赭曲露毒素A 的限量標準分類最為詳細，未加5工谷物為口 g/kg,由未加工的谷物制備的所有產品.包括 加工的谷物制品及直接供人食用的食物為u g/kg,供嬰幼兒食用的谷類加工食物和嬰兒食物 為ug/kg°我國對食物中赭曲

7、霉毒素A的限量標準（GB 2761-2020）是：谷物及其制品45 u g/kg；豆類及其制品W5ug/kg.我國對飼料中赭曲零毒素R的限量標準（）是：配合飼 料和玉米W100ug/kg。表1我國飼料中的赭曲霉毒素A限量標準產品名稱限量/（ug/kg）谷物及其加工產品<100配合飼料<100二、檢測方式及研究現(xiàn)狀真菌毒素的檢測方式要緊有兩種，一是將色譜技術作為基礎的物理化學檢測方式，包括 高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作進程太復 雜，國際上近些年利用這種方式檢測真菌毒素的情形愈來愈少；二是免疫化學檢測法，要緊 指免疫親和柱法（IAC）

8、和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。GC可同時檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標準曲線線性關系不睬想、測按 時需要進行衍生化、上一次進樣待測物品滯留、重復進樣變異系數大使得重現(xiàn)性較差等一系 列問題。HPLC法雖可精準進行定性定量測定，可是樣品前處置較為繁瑣、儀器昂貴而本錢 高，同時需要專門的技術操作人員，因此一樣用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機構的定 量分析。ELISA檢測黃曲霉毒素，樣品前處置步驟簡單且可實現(xiàn)定量化，但這種生物學方式, 受環(huán)境因素阻礙大，所用抗體和酶專門容易發(fā)生變質，現(xiàn)在市場上的同一物質試劑盒檢測結 果不同性較大，穩(wěn)固性還有待提高。相較較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀

9、器、所需輔助試劑少、交叉反映率低、試紙 條易于保留且可單份測定，幸免了分析步驟繁瑣、本錢高等缺點，而且因其檢測更快速、操 作更簡單，測試人員無需進行專業(yè)培訓，因此更適合食物平安快速檢測行業(yè)的快速查驗和基 層檢測，尤其是野外和偏遠地域人員現(xiàn)場應用此項技術十分方便。（四）制定標準的必要性和意義一、提高農產品質量的需要赭曲客毒素A是由產毒真菌產生的代謝物，普遍存在于糧油食物和飼料中。這些產毒真 菌散布于各級食物鏈，即便是在現(xiàn)今擁有先進的農業(yè)技術和食物加工工藝的條件下，在作物 種植、收成、儲藏和加工進程中，仍然無法幸免和避免產毒真菌的危害。隨著我國經濟快速 進展，人民群眾物質文化生活水平不斷提高，對食

10、物平安的關注進一步提高，迫切需要相應 的檢測技術，鑒于傳統(tǒng)檢測方式的專業(yè)性要求高和本錢昂貴的缺點，赭曲強毒素A快速檢測 技術的研究及制訂相應的檢測方式標準是超級必要的。二、實現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要赭曲霉毒素A是曲霉菌屬和青霸菌屬的某些種產生的二級代謝產物，包括赭曲毒毒素A、 赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D四種結構類似的化合物，其中散布最廣、產毒 量最高、毒性最大、對農作物的污染最重、與人類健康關系最緊密的是赭曲霉毒素A,普遍 存在于飼料、谷物及動物體內，能夠致使動物的免疫抑制、腎萎縮、胎兒崎形、流產及死亡, 并具有高度的致癌、致畸、致突變的作用，國際癌癥研究機構將其定

11、為2B類致癌物。3、適應市場經濟和加入WTO新形勢的需要我國已經加入WTO,我國農產品已面臨國際和國內兩個市場，為我國農產品（勞動密集 型）進入國際市場提供了專門好的機緣，但國際上十分重視農產品的平安問題，而農產品易 于被真菌污染，可能存在赭曲霸毒素A等真菌毒素殘留問題，這已成為阻礙出口創(chuàng)匯的最大 制約因素。由于毒素殘留超標，引發(fā)外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合一樣事件常常發(fā) 生，給我國農產品生產者造成專門大損失，并阻礙了我國農產品的形象。為了從源頭保證農 產品質量，提高我國農產品的競爭力，研究赭曲霉毒素A快速檢測技術并制訂相應的檢測方 式標準是超級必要的。二、標準制定進程飼料原料中赭曲霉毒

12、素R的快速篩查膠體金免疫層析法標準由江西省獸藥飼料監(jiān) 察所、中檢環(huán)貿生物技術（北京）、雙胞胎（集團）股分、江西正邦科技股分負責起草編寫。 依照國家有關標準制定和修訂工作的要求，標準起草單位在飼料原料中赭曲霉毒素A的快 速篩查膠體金免疫層析法的起草編制進程中，要緊工作包括以下幾個方面：（1）詳細查閱了國內、國外有關標準和相關專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻等技術資料, 并對這些資料進行了詳細的對照，從方式的先進性、靠得住性和有效性等幾個方而考慮，選 取了幾個代表性的參考資料作為標準起草中的要緊技術參考文本。（2）及時購買相關的實驗儀器、試劑、標準品和其他材料，成立了膠體金免疫層析法 的反映體系，試探不

13、同條件對方式進行最優(yōu)化，最終確信了最正確的檢測方式。（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方式的實驗，包括小麥、大米、黃豆、玉米、 豆粕、花生粕、DDGS,這是方式的重要步驟和關鍵環(huán)節(jié)。不一樣品用同一種方式進行實驗和 驗證，確保本檢測方式能夠靈敏、特異、準確地檢測出飼料原料中OTA的含量。如：方式的 靈敏度，選取多份陰性樣品平行測定，以均值加3倍標準差的方式確認檢測限符合要求：方 式的準確率，通過對體會證的陽性樣品進行檢測，取得本檢測方式的標準誤差及變異系數， 確保本方式的檢測結果靠得?。涸现蠴TA殘留。方式的批間穩(wěn)固性，選取多份確證濃度的 陽性樣品進行不同批次的平行測定，計算批間變異系數，確

14、保OTA毒素測定的批間穩(wěn)固性。（4）在技術指標完成實驗工作以后，嚴格依照標準的格式，起草編寫標準文本內容和 編制說明內容。三、標準制定依據本標準是依照GB/T標準化工作導那么第1部份：標準的結構和編寫、GB/T標 準編寫規(guī)那么第4部份：實驗方式標準的要求而進行編寫的。有關技術內容是在參考國 外有關標準及文獻的基礎上經研究、改良和驗證后制定的。四、標準技術內容和技術指標的論證（一）技術原理本方式應用了競爭疫層析原理。利用一個能夠特異性識別某一分子或某分子家族的抗體 和配對的抗原，將抗體標記膠體金顆粒，將配對的抗體噴涂到反映膜上做檢測線。檢測進程 中，若是樣品中含有待檢測物質，那么待檢測物質第一與

15、膠體金顆粒標記的抗體結合形成復 合物，以后沿反映膜向吸水紙方向流動，抵達檢測線時，因為待檢測分子表而的表面決定簇 大部份已經被抗體占據，少量與檢測線處的抗原結合，形成比較淺的色帶，待檢測物質-膠 體金顆粒標記的抗體結合形成復合物繼續(xù)沿反映膜流動，抵達質控線后被質控線處的膠體金 顆?？贵w所捕捉，形成清楚可見的色帶。反映完成后，利用讀數儀讀取檢測區(qū)域和質控區(qū)域 的顏色強度信號，依照內置標準曲線計算出樣品中OTA毒素的含量。（二）適用范圍本標準規(guī)定了膠體金法測定飼料原料樣品中赭曲霉毒素A的條件和詳細分析步驟。本方式適用于小麥、大米和玉米等谷物中赭曲花毒素A毒素快速定量篩查的測定，檢測 限為2 u g

16、/kgo（三）關于樣品制備的要求理論上講樣品顆粒的大小與樣品的均勻性和毒素的提取效率有關，當樣品細度不足20 目時，真菌毒素的提取效率較低，因此國家標準方式中真菌毒素檢測的制樣一樣都要求制備 至少500g,全數通過20目篩，本行業(yè)標準直接采納，從測試數據看，能夠知足方式需求。（四）方式周密度及準確度采納5Pg/kg. lOPg/kg和20 gg/kg三個濃度水平的陽性樣品，每一個濃度水平測定10 次，重復測定的變異系數在4%-13*之間，平均變異系數為樂 結果見表2。表2飼料樣品中赭曲客毒素A檢測數據分析表（濃度：Pg/kg）編號測定結果參考濃度（Mg/kg）51020151122261023

17、3510214611205412226610207511228610219512221051123平均結果（Mg/kg）標準偏差變異系數（給（五）檢測限取20份陰性樣品平行測定，結果均值加3倍標準差為，本方式的檢出限為2Ug/kg,陰 性樣品結果見表3。表3陰性飼料樣品赭曲帶毒素A測定結果分析表（濃度：Ng/kg）樣品編號測定結果112030415060718090100110121130140151160171180190200平均結果（Hg/kg）標準偏差檢測限（Ng/kg）(六)批間穩(wěn)固性采納5 Pg/kg左右濃度水平的陽性樣品，不得低于6個批次，每一個批次測定不低于2 次，批內測定取平

18、均值，通過批間變異系數來表達，變異系數應25軋經多批次平行測定, 次方式符合變異系數要求，批間穩(wěn)固性良好，結果見表4。表4飼料樣品赭曲帶毒素A批間穩(wěn)固性測定數據分析表(濃度：Mg/kg)批次號測定結果 (Mg/kg)批次內平均值(理:/kg)參考濃度(Pg/kg)批次間平均值(Mg/kg)標準偏差變異系數(%)145525435646665546666(七)HPLC和膠體金定量檢測條結果比對隨機抽取小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品，用本方式和儀器方式別 離進行檢測。儀器方式參考GB/T 30955-2021飼料中赭曲蠹毒素A、B二、G一、G2的測定免 疫親和柱凈化-高效液相色譜，對赭曲寄毒素A的檢測限為ug/kg,定量限為ug/kg。本方 式的檢測限為