新型維甲酸衍生物ATPR對(duì)腫瘤細(xì)胞株SKOV3增殖及分化的影響

1、新型維甲酸衍生物ATPR對(duì)腫瘤細(xì)胞株SKOV3增殖及分化的影響吳繁榮，洪凡青，陳飛虎（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230032）摘要 目的：本研究探討新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖及分化作用。方法：ATPR作用于細(xì)胞株SKOV3后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖；吉姆薩染色法在倒置相差顯微鏡下觀(guān)察加藥處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；ELASA法檢測(cè)卵巢癌標(biāo)志物糖鏈抗原125(CA125)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果：ATPR呈濃度依賴(lài)性抑制SKOV3細(xì)胞

2、增殖，明顯抑制作用出現(xiàn)在藥物作用48h，但在72h后則更顯著；倒置顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)趨于成熟分化；SKOV3中CA125水平下降；流式細(xì)胞儀測(cè)定G0/G1期細(xì)胞表達(dá)量增加，S期細(xì)胞表達(dá)量減少，細(xì)胞周期進(jìn)程受影響，細(xì)胞阻滯在G0/G1期。結(jié)論：ATPR對(duì)SKOV3細(xì)胞具有抑制增殖和一定的誘導(dǎo)分化作用。關(guān)鍵詞：ATPR；SKOV3細(xì)胞；增殖；誘導(dǎo)分化 作者簡(jiǎn)介：吳繁榮，男，碩士，講師，研究方向：分子藥理學(xué)，TelE-mail：aydwfr 陳飛虎，通訊作者，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子藥理學(xué)，TelE-mail：cfhchin

3、a本課題受?chē)?guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(NO:2011ZX09401-021)、國(guó)家自然科學(xué)基金（NO：81100301）資助Effects of a new the retinoic acid derivatives ATPR on proliferation and differentiation of SKOV3 tumor cellWU Fan-rong，HONG Fan-qing， CHEN Fei-hu（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）Abstract Objective:To explore t

4、he effect of the 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate (ATPR) on the proliferation and differentiation of SKOV3 tumor cell in vitro.Methods: Cell proliferation was assessed by MTT assay and growth curve of cells; Morphologic changes were observed after Giemsa staining using inverted phase contra

5、st microscope; CA125 were measured by ELISA;The cell cycle were analyzed by Flow Cytometry( FCM).Results:The growth of SKOV3 cells was inhibited in a does-dependent manner after the treatment with ATPR.The phanero depressant effect appeared at 48 hours,but it is significanter after 72 hours;Cell mor

6、phous was observed to be mature in inverted microscope; The content of CA125 decreased; The proportion of cells in G0/G1 phase increased while the cells in S phase decreased.Cell cycle progression was blocked in the G0/G1 phase. Conclusion:ATPR could inhibit the proliferation and induce differentiat

7、ion in some degree.The direction of differentiation is still need further study.Key words:ATPR;SKOV3 cell line;proliferation;induced differentiation 維甲酸( retinoic acid，RA)及其衍生物是誘導(dǎo)分化劑中最為重要并已用于臨床治療的一類(lèi)藥物，由維生素 A( 包括視黃醇、視黃醛、視黃酸)衍生而成。本實(shí)驗(yàn)室以維甲酸為先導(dǎo)化合物，對(duì)其碳鏈末端極性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，并對(duì)環(huán)己烯環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列全新的維甲酸衍生物，并進(jìn)行了體外抗腫瘤活性

8、實(shí)驗(yàn)1。經(jīng)藥物構(gòu)效學(xué)篩選，其中4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，有望成為一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的誘導(dǎo)分化新藥。為研究其抗卵巢腫瘤的作用，我們以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為模型，體外觀(guān)察其對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、分化的作用，為開(kāi)發(fā)新的有效的抗癌藥物提供依據(jù)。1 材料與方法 1.1藥物與試劑 細(xì)胞株：SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibico 公司產(chǎn)品，小牛血清購(gòu)自杭州四季清生物公司，青霉素購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠(chǎng)， 鏈霉素為深圳華藥南方制藥有限公司產(chǎn)品

9、。二甲亞砜、 佛波酯(TPA) 、RNase A、碘化丙啶(propidium Iodide，PI),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品。新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成（批號(hào)：20100301，其結(jié)構(gòu)如圖1所示），溶于DMSO配制成110-2 mol/L濃度，于-20儲(chǔ)存?zhèn)溆?。圖1 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(ATPR)化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of 4-amino-2-trifluoromethy

10、l-phenyl retinate(ATPR)1.2儀器和設(shè)備 電子天平：BT253型，德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；精密pH計(jì)：PHS-3C，上海雷磁儀器廠(chǎng)；CO2培養(yǎng)箱：2306-Z，美國(guó)SHELLAB公司； 3-16K， SIGMA公司；流式細(xì)胞儀：EPICS XL-MCL型，美國(guó)庫(kù)爾特公司；顯微鏡：eclipse te300，nilon公司。1.3細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞株采用含10%小牛血清的RPMI1640并加入青霉素100 IU/ mL 和鏈霉素100g/mL 的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 、5 %的CO2 培養(yǎng)箱，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4 SKOV3細(xì)胞增殖狀況 將SKOV

11、3細(xì)胞以5104/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種量為100 L。待細(xì)胞貼壁后，分為實(shí)驗(yàn)組（ATPR，濃度分別為110-9、110-8、110-7、110-6、110-5 mol/L）、空白對(duì)照組（加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 L）、陽(yáng)性對(duì)照組（維甲酸ATPR為陽(yáng)性對(duì)照藥，110-5 mol/L）、溶劑對(duì)照組（無(wú)水乙醇）。每孔的總體積為200 L。分別于24h、48h、72h、96h后加入MTT（濃度為5 mg/mL）20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，每孔加入150 L的DMSO，震蕩搖勻，使甲瓚顆粒充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，以波長(zhǎng)490nm，試劑對(duì)照組調(diào)零，測(cè)吸光度（

12、A490）值2，每種處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取其平均值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（對(duì)照組平均A490值實(shí)驗(yàn)組平均A490值）/對(duì)照組平均A490值100。1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，以1105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種于六孔板中，每個(gè)孔加入蓋玻片，將細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，每個(gè)孔加入不同濃度的ATPR（110-9、110-8、110-7、110-6、110-5 mol/L）、陽(yáng)性對(duì)照藥維甲酸（110-5 mol/L）、空白對(duì)照（加入等體積的1640）和溶劑對(duì)照組無(wú)水乙醇于10%FCS的1640培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。作用72h后，收集蓋玻片，用PBS沖洗蓋玻片，然后用甲醇固定10分鐘，吉姆

13、薩染色15分鐘，流水沖洗，干燥，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。1.6 SKOV3細(xì)胞的CA125的測(cè)定 將SKOV3細(xì)胞以1106/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，待貼壁后，給藥同細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察中的方法實(shí)驗(yàn)分組，經(jīng)藥物作用72h后，收集SKOV3細(xì)胞，用0.25胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，低速離心后用0.5ml 0.2Triton X-100溶解細(xì)胞，震蕩30min，離心取上清。參照ELISA試劑盒方法分別在520 nm處測(cè)定CA125吸光度。1.7 細(xì)胞周期及DNA倍體分析 細(xì)胞培養(yǎng)和給藥同細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察中的方法，收集經(jīng)藥物作用后的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，70%冷乙醇-20 冰箱固定過(guò)夜。固

14、定后的細(xì)胞離心，棄上清，加入碘化丙啶（PI，終濃度為100g/mL）和RNase（終濃度為50g/mL），4 避光染色30 min后，在EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀上分析，檢測(cè)104以上細(xì)胞，并用Muticycle軟件進(jìn)行DNA倍體及細(xì)胞周期分析。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，采用SPSS 15.0軟件分析結(jié)果。多組資料之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（ATPR）對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的ATPR作用細(xì)胞24h、48h、72h、96h后，24h時(shí)藥物對(duì)細(xì)胞抑制作用不明顯，其他時(shí)間點(diǎn)A

15、TPR對(duì)細(xì)胞增殖均具有不同程度的抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系，其中110-5mol/L抑制效應(yīng)最強(qiáng)，在72h抑制效應(yīng)達(dá)到最大，卵巢癌SKOV3最高抑制率達(dá)78.4%。與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組A490變化不明顯，表明使用無(wú)水乙醇作為溶劑對(duì)細(xì)胞增殖改變的影響不顯著，見(jiàn)表1。表1 ATPR對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響（xs,，n3）Table 1 ATPR on the proliferation of SKOV3 cells detected by MTT（Xs，n3） 組別濃度 (mol/L)A49024h48h72h96h空白組0.2330.0080.3960.0070.5240.0270.70

16、00.044乙醇對(duì)照0.2250.0130.397 0.0050.5380.0290.7040.007ATPR110-50.2300.0280.3290.004c0.4050.029 c0.5420.032 c110-60.2350.0250.3330.017 c0.4120.013 c0.6240.061 b110-70.2310.0090.3590.017 c0.4390.045 c0.6320.058 b110-80.2340.0150.3900.0070.4620.024b0.6500.028110-90.2350.0090.3910.0060.5150.0140.6540.024AT

17、RA110-50.2380.0330.3110.010 c0.3970.019 c0.5320.014 c與空白組比較bP0.05，cP0.01 2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3在濃度（110-9mol/L110-5mol/L）范圍的ATPR、維甲酸（110-5mol/L）和無(wú)水乙醇作用72h后，吉姆薩染色后倒置顯微鏡下觀(guān)察顯示：卵巢癌細(xì)胞株SKOV3空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分裂相較多，細(xì)胞透明，細(xì)胞間連接緊密，核大而圓，形態(tài)多樣，多角形或短梭形。ATPR組大體可見(jiàn)細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞趨向規(guī)則形，細(xì)胞核質(zhì)比例縮小，細(xì)胞形態(tài)隨著藥物濃度的增加改變?cè)矫黠@，以ATPR 110-5mo

18、l/l組最為顯著，提示ATPR作用后SKOV3細(xì)胞向較成熟的粒細(xì)胞階段分化，見(jiàn)圖2。圖2 不同濃度ATPR作用于SKOV3細(xì)胞72h形態(tài)學(xué)變化（400）Fig.2 SKOV3 cells treat with different concentrations of ATPR after 72 h morphological changes（400）1:空白組; 2:乙醇對(duì)照組; 3:ATPR（110-5 mol/L）; 4:ATPR（110-6mol/L）; 5:ATPR（110-7mol/L）; 6:ATPR（110-8mol/L）;7:ATPR（110-9mol/L）; 8: ATRA（1

19、10-5 mol/L）2.3 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（ATPR）對(duì)SKOV3細(xì)胞CA125含量的影響經(jīng)過(guò)藥物作用72h后，CA125含量隨濃度的升高而下降，以藥物濃度10-5 mol/LCA125下降最為顯著，相對(duì)于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。表2 SKOV3細(xì)胞的CA125含量影響(xs, n=3 )Table2 The effect of CA125 of SKOV3 cells treated with different concentrations of ATPR for 72 h. (xs, n=3 )組別濃度(mol/L)CA125(U/ml)空白組乙醇對(duì)

20、照組ATPR ATRA110-5110-6110-7110-8110-9110-513.352.9013.431.957.861.29 c10.220.24 b11.761.5212.061.5912.731.488.232.23 c與空白組比較bP0.05，cP0.012.4 細(xì)胞周期及DNA倍體分析FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分析顯示，與空白對(duì)照組相比，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照藥維甲酸（10-5mol/L）和ATPR（10-5-10-8mol/L）作用于SKOV3細(xì)胞72h，ATPR 10-6、10-7mol/L G1期細(xì)胞百分比上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），ATPR 10-5、10-6mol/LS期細(xì)胞

21、百分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），ATPR 10-7mol/LS期細(xì)胞百分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。G2/M期細(xì)胞改變不明顯。表明細(xì)胞周期進(jìn)程受影響，細(xì)胞阻滯在G0/G1期，見(jiàn)圖3。 123645 78c b c c b b b 圖3 不同濃度的ATPR對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的改變(xs, n=3 )Fig.3 The change of cell cycle distribution of SKOV3 cells treated with different concentrations of ATPR for 72 h. (xs, n=3 )1:空白組; 2:乙醇對(duì)照

22、組; 3:ATPR（110-5 mol/L）; 4:ATPR（110-6mol/L）; 5:ATPR（110-7mol/L）; 6:ATPR（110-8mol/L）;7:ATPR（110-9mol/L）; 8: ATRA（110-5 mol/L）與空白組比較bP0.05，cP0.01 5 討論維甲酸類(lèi)化合物是一組天然的或合成的具維生素甲基苯結(jié)構(gòu)和活性的化合物。有著極其廣泛的生理作用和治療功能，全反式維甲酸（ATRA）是維生素A的生物活性物，1986年國(guó)學(xué)者率先應(yīng)用ATRA對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL) 進(jìn)行誘導(dǎo)分化治療， 獲得了極大成功， 開(kāi)創(chuàng)了誘導(dǎo)分化治療人類(lèi)腫瘤的新思路，使 APL的治療

23、有了質(zhì)的飛躍。該方法一反藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的傳統(tǒng)機(jī)制， 使用藥物誘導(dǎo)惡性細(xì)胞分化成熟取療效成為現(xiàn)實(shí)3,4，已有研究表明：ATRA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)分化的雙重作用，但其藥理學(xué)劑量又具有較強(qiáng)的毒性 5。此外，一些維甲酸類(lèi)化合物水溶性差，以及給藥靶向性不好等，這些都限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。因此，尋找具有更好療效的維甲酸衍生物吸引了許多合成化學(xué)家的興趣6,7 。本課題組前期研究中，以全反式維甲酸為母核，在極性端基部位引入含三氟甲基苯酚或三氟甲基苯胺結(jié)構(gòu)的化合物，合成一系列新型維甲酸酯和酰胺衍生物，本實(shí)驗(yàn)以新合成的ATRA衍生物-ATPR為目標(biāo)藥物，觀(guān)察其對(duì)SKOV3細(xì)胞株的影響。研究發(fā)現(xiàn)A

24、TPR能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，不同藥物濃度分別作用于細(xì)胞24h、48h、72h、96h，以110-5mol/L抑制率最高。抑制作用出現(xiàn)在48h，而在72h抑制效應(yīng)尤為顯著。細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞分化主要表現(xiàn)在形態(tài)和功能兩個(gè)方面。形態(tài)分化是細(xì)胞分化的表形特征， 也是最基本的特征， 能客觀(guān)地反應(yīng)分化誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用8,9，形態(tài)學(xué)上的分化成熟是表明惡性腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志10。經(jīng)過(guò)ATPR作用72h的SKOV3細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有趨向成熟的改變，染色后可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，核質(zhì)比例降低，核縮小，核仁減少或消失，核染色質(zhì)由疏松趨向致密，核多偏于一側(cè)，胞核有切跡、凹陷，部分呈腎形或不規(guī)則形，

25、說(shuō)明ATPR能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞分化。CA125是卵巢上皮退行性分化的腫瘤標(biāo)志物，在卵巢癌細(xì)胞及病人血清中常高表達(dá)，在人體正常卵巢組織及血清中不表達(dá)或低表達(dá)，與卵巢癌細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)，其敏感性可達(dá)81，CA125的分泌量對(duì)觀(guān)察療效及預(yù)后有重要的意義11。本實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到ATPR對(duì)SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CA125的活性有明顯的下調(diào)作用，以ATPR110-5mol/L組作用最為顯著。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要特征是細(xì)胞增殖和分化失去了控制，細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生紊亂，大量細(xì)胞處于DNA合成活躍的S期和分裂旺盛的M期，細(xì)胞呈惡性增殖。因此，調(diào)控細(xì)胞周期并將其

26、阻滯在G0/G1期是鑒定誘導(dǎo)物誘導(dǎo)分化效果的重要指標(biāo)12,13。流式細(xì)胞光度術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，ATPR誘導(dǎo)下的SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)分化細(xì)胞特有的周期分布，即呈現(xiàn)出G1期延滯和G-S期轉(zhuǎn)換的抑制，這是處于分化過(guò)程中的細(xì)胞所具有的共同特征。綜上所述，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新型維甲酸衍生物ATPR對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3具有抑制增殖和誘導(dǎo)分化的作用，但ATPR的誘導(dǎo)分化作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)1 Shen J，Shi JB，Chen FH，et al.Synthesis and anti-tumor activity of all-trans retinoic acid derivativesJ.Chi

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