常溫組織RNA提取

1、常溫組織RNA提取注意事項(xiàng)背景知識(shí) 高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首選。總RNA的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的RNA酶，確保了RNA的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品主要是植物，其它絕大部分樣品的RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。RNA抽提的問題，簡單可歸納為三個(gè)：降解、純度、得率。判斷這三個(gè)指標(biāo)的基本手段是：電泳和紫外分光光度儀。降解只能通過

2、電泳判斷；純度和得率主要使用紫外分光光度儀檢測(cè)，但電泳也可以提供簡單參考。要正確解讀電泳或者紫外分光光度儀的結(jié)果，首先就要對(duì)這兩個(gè)方法有基礎(chǔ)的了解。如果抽提基因組DNA的最大問題是純度，那么，抽提總RNA的最大問題是降解。降解主要來自兩個(gè)方面：樣品的內(nèi)源酶的作用和最后溶解用水及離心管的不干凈。對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)人員來說，RNA抽提比基因組DNA抽提要困難得多。事實(shí)上，現(xiàn)有的 RNA抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA，比抽提基因組DNA更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織RNA的抽提，總會(huì)碰到問題呢？ 組織RNA抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問題，

3、首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA不容易降解?，F(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸并被及時(shí)裂解，所以其RNA不容易被降解；反過來講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方

4、法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase活性這個(gè)問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的Rnase降解RNA的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎100%能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同?？傊?，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)

5、行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì)用嘴碾磨，腸胃抽提。 基因組DNA殘留，是一個(gè)容易被廠家糊弄的概念。如果你判斷基因組 DNA是否殘留的標(biāo)準(zhǔn)是電泳，那么，許多產(chǎn)品都可以做到“無基因組 DNA殘留”。這時(shí)，你需要問一下：基因組 DNA殘留影響的后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要是什么？是 PCR。理論上，PCR的靈敏度是一個(gè)分子，也就是 pg級(jí)的 DNA殘留；電泳可以看見 DNA條帶的極限，則不小于 ng級(jí)。電泳看不見 DNA殘留的意義是，DNA殘留少。實(shí)踐證明，無論是 TRIzol方法、柱離心式方法、甚至包括柱內(nèi) DN

6、ase I消化 DNA的方法，都無法確保徹底去除 DNA；真正能徹底去除 DNA殘留的方法，只有液體體系下 DNase I的消化。實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備究竟怎樣才能確保RNA抽提的成功率呢？實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備是非常重要的。首先，要了解你的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，了解你的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中可能存在的隱患：是否有同事在進(jìn)行DNA抽提？是否實(shí)驗(yàn)室人員眾多？第二，要了解你可以使用的設(shè)備：離心機(jī)是否可以低溫操作？破碎、勻漿的條件怎樣？第三，要了解抽提RNA的目的。第四，要了解樣品的采集、制備、保存的條件，了解樣品的特點(diǎn)。在對(duì)上面四點(diǎn)有了充分的了解后，才能正確選擇合適的方法/試劑，提高抽提的成功率。選擇合適的方法/試劑，這是非常重要的一步；

7、好的方法/試劑在確保成功的同時(shí)，操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。0：抽提RNA的目的RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的RNA為目的，勞民傷財(cái)。1：樣品的收集/保存影響降解的因素樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開始降解RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入

8、液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。液氮碾磨是杜絕內(nèi)源酶作用的好方法；但如果在碾磨過程中；因?yàn)闆]有及時(shí)補(bǔ)充液氮導(dǎo)致樣品融化，則總RNA被降解得更快。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。 樣品勻漿后的保存，在-20C可以保存一個(gè)月左右，但最好使用更低溫度保存。新鮮樣品的保存，則首先使用液氮速凍，再轉(zhuǎn)移到-70C以下溫度保存。新鮮樣品直接保存還要注意一點(diǎn)，就是先將樣品分割成小塊后再保存，而不是大塊保存，用前再分割。采集的組織也可以放入RNAguard中保存，-2

9、0C一年不會(huì)降解。2：樣品的破碎及勻漿影響降解和得率的因素樣品的粉碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使細(xì)胞破裂，使總RNA徹底完整地釋放出來。一般講來，細(xì)胞無須粉碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的粉碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過程中，樣品不得融化，因?yàn)?/p>

10、冷凍過的樣品內(nèi)必定形成冰晶，破壞了細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)源酶更容易起作用。帶針頭的一次性注射器是一個(gè)非常有用的工具。與玻璃允漿器相比，它有三大優(yōu)點(diǎn)：非常方便；允漿更徹底；可以更好地打斷基因組DNA，從而降低裂解液黏度。強(qiáng)烈建議在抽提總RNA前準(zhǔn)備一些一次性注射器，以便在實(shí)驗(yàn)過程中，一旦發(fā)現(xiàn)裂解液體系較為粘稠，可以及時(shí)解決。3：裂解液的選擇影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制Rnase活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有兩個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力；部分樣品(主要是植物)不能使用含苯酚的裂解液/或者只能使

11、用某些特別的裂解液。4：純化方法的選擇影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，且重復(fù)性高，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長，重復(fù)性較低。抽提操作中的注意事項(xiàng)抽提操作中的主要事項(xiàng)，首先要參考試劑供應(yīng)商的建議。無論使用的是柱離心式抽提方法，還是經(jīng)典抽提方法，下面幾點(diǎn)注意事項(xiàng)都是通用的。  1：操作快速。

12、主要指從樣品脫離其正常生長條件到徹底勻漿之間的時(shí)間要盡可能短。樣品被徹底勻漿后，RNA是相對(duì)穩(wěn)定的；此時(shí)保持正常的操作速度就可以了。  2：樣品要一個(gè)一個(gè)裂解。在同時(shí)抽提多個(gè)樣品時(shí)，操作應(yīng)該是：取出一個(gè)樣品，加入裂解液，徹底勻漿，置于冰上；再取出第二個(gè)樣品同樣處理，直到樣品全部處理完畢。再同步繼續(xù)后面的操作。絕對(duì)不能在所有樣品中加入裂解液后再一個(gè)一個(gè)勻漿。  3：樣品不要過量。RNA抽提如果出現(xiàn)了問題，除了沒有獲得RNA外，全部都可以由樣品過量引起。換一個(gè)講法，如果你的起始樣品量比較大，而抽提又出現(xiàn)了問題，你就不容易直觀找到原因。樣品凍融的影響實(shí)驗(yàn)表明，

13、冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發(fā)生RNA的降解?？赡艿脑蚴牵簝鋈谶^程破壞了細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源酶更容易與RNA直接接觸。下面是發(fā)生凍融的幾種常見情況：1：冷凍保存的樣品，抽提前的切割。2：冷凍保存樣品，抽提前稱重。3：液氮碾磨過程中沒有及時(shí)補(bǔ)充液氮。4：冷凍樣品不經(jīng)過液氮碾磨直接加入裂解液勻漿。如果操作中存在樣品凍融的可能，而所獲得的RNA也出現(xiàn)了比較強(qiáng)烈的降解，就一定要去除/降低凍融的影響。RNAguard保存的樣品沒有凍融問題。RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑確保RNA不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。抽提前

14、先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。碾磨過程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時(shí)，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿.安全的稱重幾乎不可能。這么嚴(yán)格的操作，是沒有多少實(shí)驗(yàn)人員去認(rèn)真執(zhí)行的。RNAguard能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的RNA在37C一天不降解，25C一周不降解，4C一個(gè)月不降解，-20C一年以上不降解。RNAguard適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，昆蟲，及部分植物組織。經(jīng)過RNAguard處理的樣品可以用幾乎所有常用的RNA方法/試劑抽提RNA，所有的操作與用新鮮組

15、織沒有什么不同。使用RNAguard的操作非常簡單：在取組織前預(yù)先估計(jì)組織的重量，在一個(gè)容器中加入5-10倍體積的RNAguard，放在手邊。取出所需組織后，立即切割成厚度小于0.5厘米，放入含 RNAguard的容器中即可。抽提前先用鑷子將組織從RNAguard中取出，在室溫進(jìn)行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。如果您面臨下面的情況之一，您一定會(huì)發(fā)現(xiàn)使用RNAguard的好處： 1：實(shí)驗(yàn)室沒有液氮罐或者70C冰箱保存樣品。2：易降解樣品的RNA抽提或者抽提RNA經(jīng)常碰到降解問題。3：樣品必須準(zhǔn)確稱重。4：大規(guī)模RNA的抽提。5：樣品的采集手術(shù)室，野外等。67：樣品的郵寄。 RNA抽提的“三

16、大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。   注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。   注意二：認(rèn)真處理實(shí)驗(yàn)所涉及到的試劑、耗材、環(huán)境。：阻止內(nèi)源酶的活性   注意三：選擇合適的勻漿方法。   注意四：選擇合適的裂解液。   注意五：控制好樣品的起始量。   注意六：勻漿操作快速而徹底。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的   注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。   注意八：RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次

17、成功，而不是得率。 Rnase污染的10大來源  1：手指頭手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。  2：槍頭，離心管，移液器單純的滅菌是不能滅活Rnase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。  3：水/緩沖液一定要確保無Rnase污染。  4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用75%的酒精棉球搽拭

18、干凈。  5：內(nèi)源Rnase 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。  6：RNA樣品 RNA抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的Rnase污染。  7：質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到Rnase降解RNA，殘留的Rnase要用Proteinase K消化，PCI抽提。  8：RNA保存即使低溫保存，痕量的Rnase亦會(huì)導(dǎo)致RNA降解。長期保存RNA的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。  9：陽離子

19、(Ca, Mg) 在含這些離子時(shí)，80C加熱5分鐘會(huì)導(dǎo)致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。  10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶酶均有可能被Rnase污染。RNA抽提的10大竅門 1：快速阻止Rnase活性樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活Rnase。  2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。  3：預(yù)判質(zhì)量要求 Northern，cDNA文庫構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease prote

20、ction assay)對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR對(duì)純度(酶抑制物殘留)要求很高。  4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。  5：檢查 RNA的完整性電泳檢測(cè)，28S:18S =2:1是完整的標(biāo)志，1:1對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。  6：去除DNA 用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。  7：降低外源酶的污染不能從外面又導(dǎo)入酶。  8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。  9：徹底

21、溶解RNA，必要時(shí)可以65C加熱5分鐘。  10：合適的保存方法短時(shí)間可以20C保存，長期請(qǐng)保存于80C。提高RNA得率的方法首先要知道，不同的樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟、胰腺、心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦、胚胎、腎臟、肺、胸腺、卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱、骨、脂肪。如果得率低與抽提有關(guān)，下面是可能提高得率的建議：   1：使用更有效的破碎/勻漿方法。RNA如果不能被有效釋放出來，得率是會(huì)降低的。液氮搗碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、電動(dòng)勻漿器勻漿，雖然麻煩，

22、但都是獲得高得率的有效手段。  2：抽提試劑的更換。假如得率低不是由勻漿方法不徹底引起，則可能是所使用的試劑的裂解能力差導(dǎo)致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后換廠家。另外，可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的試劑/方法；使用苯酚/氯仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的損失是比較大的。  3：延長沉淀時(shí)間。如果核酸濃度低，采取低溫沉淀、并延長沉淀時(shí)間，可以獲得非常好的效果。較難抽提樣品總RNA抽提方法/試劑的選擇貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：從貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中抽提總RNA，首先是要徹底去除培養(yǎng)液，然后再裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞可以直接在培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行；也可以先將細(xì)胞脫

23、壁，移入離心管，再在離心管中進(jìn)行。如果裂解直接在培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)榕囵B(yǎng)液是不可能徹底去除的，其殘留液體將降低裂解液中所有鹽的濃度：司裂解的鹽的濃度降低導(dǎo)致裂解效率降低，司沉淀的鹽的濃度降低導(dǎo)致沉淀效率降低，綜合效果就是降解或者得率低。由于液體的殘留量是取決于容器面積的，所以，如果采用直接在培養(yǎng)容器內(nèi)裂解細(xì)胞的方法，裂解液的用量要依據(jù)培養(yǎng)容器的面積而調(diào)整，而不是根據(jù)細(xì)胞數(shù)使用-這就是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞抽提總RNA的關(guān)鍵所在。脫壁后裂解的方法，可能碰到的最大問題是，在脫壁過程中部分細(xì)胞破碎，這會(huì)降低得率。綜上所述，小面積的貼壁細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)少，得率很重要：不要使用可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)損失的脫壁后裂解的方法

24、，要使用直接在容器內(nèi)裂解的方法，但要注意增大裂解液的用量；大面積的貼壁細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)多，可以使用可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)損失的脫壁后裂解的方法，因?yàn)樗梢怨?jié)約很多裂解液。纖維組織：從心臟、骨骼肌等纖維組織中抽提總RNA，關(guān)鍵在徹底破碎組織。一定要在液氮冷凍條件下將組織徹底磨碎后再勻漿。同時(shí)，這些組織的細(xì)胞密度低，故單位重量的組織中，總RNA的含量較少，所以，在試劑容許的范圍內(nèi)，用盡可能多的樣品，來確保獲得足夠多的總RNA。蛋白/脂肪含量高的組織：從脂肪組織、腦、及部分脂肪含量高的植物中抽提總RNA，關(guān)鍵是徹底去除脂肪。去除脂肪的最好試劑是氯仿。即使在抽提步驟中使用了苯酚/氯仿，如果發(fā)現(xiàn)上清含白色絮狀物

25、，或者液相上面還有一相，提示有脂肪殘留。此時(shí)必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。核酸含量高的組織：脾、胰腺、胸腺等核酶含量很高，同時(shí)，它們的核酸含量也非常高，降解是非常容易發(fā)生的。從這樣的樣品中抽提總RNA，最好使用含苯酚的裂解液，同時(shí)要增加裂解液用量，或者減少樣品用量。樣品在液氮冷凍條件下碾磨，再快速勻漿，方能有效滅活核酶。新鮮組織用玻璃勻漿器勻漿，非常容易導(dǎo)致降解。如果發(fā)現(xiàn)裂解液太粘稠(因?yàn)楹怂岷扛叩木壒?，苯酚/氯仿抽提后的離心分層往往會(huì)碰到問題：不是分不開，就是中間層很厚。用注射期抽打裂解物，或者加入更多裂解液，都可以部分解決此問題。最好用酸性苯酚/氯仿對(duì)上清進(jìn)行再次抽提，以去除可能殘留的

26、基因組DNA。如果在上清中加入醇后馬上有白色沉淀形成，則提示有DNA污染。溶解后用酸性苯酚/氯仿再次抽提，可以去除DNA污染。植物組織：植物組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜。一般，大家都是在液氮條件下對(duì)植物進(jìn)行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象不常見。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)所致植物中的許多雜質(zhì)，可以導(dǎo)致總RNA在抽提過程中被降解。另外，許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會(huì)導(dǎo)致殘留；之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與總RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附-這些特點(diǎn)決定了它們是非常強(qiáng)的酶抑制劑。還有一點(diǎn)也要注意，就是有些植物不能使用含某些試劑(比如苯酚)的裂解液。目前，商品化的

27、RNA抽提試劑經(jīng)過小量調(diào)整，可以適合幾乎所有的動(dòng)物組織，但卻沒有一種商品化的總RNA抽提試劑，可以適合大部分植物組織。所以，從植物樣品中抽提總RNA，一定要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，必要時(shí)對(duì)原來的操作進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。如果發(fā)現(xiàn)抽提的總RNA出現(xiàn)比較強(qiáng)烈的降解，排除了其它原因后，單純由內(nèi)源酶導(dǎo)致的具體原因及對(duì)策如下：直接在培養(yǎng)容器內(nèi)裂解的貼壁細(xì)胞：裂解液用量不足或者沒有徹底去除培養(yǎng)液，將導(dǎo)致降解。對(duì)策是：首先要徹底去除培養(yǎng)液；其次，培養(yǎng)液的用量要按照培養(yǎng)容器的面積使用。新鮮動(dòng)物組織：組織破碎不徹底，或者操作時(shí)間過長，或者裂解液用量不足。改用更強(qiáng)的破碎組織的方法，操作更快速，能解決前兩個(gè)問題。裂解液用量不足，也包括相

28、對(duì)用量即內(nèi)源酶含量高的組織，如胰腺，要使用相對(duì)比較多的裂解液。在試劑使用量方面，千萬不要死板地按照試劑使用說明進(jìn)行往往，那指的是熟手抽提最簡單樣品時(shí)的用量。最可靠的方法是，按照說明提示的一半使用組織。冷凍保存組織：保存方法不正確，或者切割秤重，或者破碎方法不正確。組織的保存，必須經(jīng)過液氮速凍后，才能移入冰箱保存。即使曾經(jīng)有過直接保存而不降解的經(jīng)歷，也不要相信總有那么好的運(yùn)氣。組織最好在保存前就已經(jīng)分割好了，冷凍保存組織的分割有非常非常大的降解風(fēng)險(xiǎn)。秤重不要去做，或者在保存前就秤好。冷凍保存樣品，包括細(xì)胞，都要使用液氮碾磨破碎，只有這樣才能確保樣品在徹底勻漿前不會(huì)出現(xiàn)融化。液氮碾磨過程絕對(duì)不能出

29、現(xiàn)液氮不足的現(xiàn)象；碾磨好后，一定要在液氮完全揮發(fā)之前，將樣品移入裂解液中迅速勻漿。植物組織：破碎方法不正確，或者裂解試劑不適用。液氮碾磨過程絕對(duì)不能出現(xiàn)液氮不足的現(xiàn)象；碾磨好后，一定要在液氮完全揮發(fā)之前，將樣品移入裂解液中迅速勻漿。裂解試劑不適用可能更普遍。有一些植物，因?yàn)閮?nèi)含某些成分，非常容易導(dǎo)致總RNA的降解。這些植物，如果使用一般的裂解液，都得不到完整的總RNA。必須在裂解液中添加某些成分，如PVP、PVPP等，去除那些導(dǎo)致總RNA降解的成分，方能獲得完整的總RNA。RNase的滅活處理(DEPC和Proteinase K)  1：高壓滅菌是可以滅活部分Rnase A

30、的。實(shí)驗(yàn)證明：37 C與RNA反應(yīng)，沒有滅菌的PBS，活性點(diǎn)為100 pg/ml；滅菌后，活性點(diǎn)為100 ng/ml。當(dāng)然，滅菌后Rnase仍然不能認(rèn)為沒有殘留。  2：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除Rnase A的濃度分別為：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC滅活后的副產(chǎn)品，對(duì)有些后續(xù)實(shí)驗(yàn)是有影響的。  3：DEPC在水中半衰期為30分鐘。0.1%的DEPC滅菌15分鐘可以認(rèn)為徹底破壞了DEPC。破壞后可以聞到一點(diǎn)氣味。  4：DEPC并不是不能處理Tris的。

31、在1M Tris、1M HEPES、1M MOPS中分別加入1ug/ml Rnase A和0.1%及1% DEPC實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示，0.1% DEPC只對(duì)MOPS有效，而1% DEPC對(duì)三種試劑都有效。  5：Proteinase K是完全可以替代DEPC滅活RNase的。其依據(jù)是：作為蛋白質(zhì)，RNase非常容易被Proteinase K消化掉；而100C 15分鐘就可以徹底滅活Proteinase K的活性。Proteinase K的用量與溶液的RNase殘留量有關(guān)，一般在溶液中加入Proteinase K至終濃度0.5 1.0 mg/L，室溫放置30分鐘以上，再高溫滅活P

32、roteinase K，就能確保RNase-Free了。 RNA的電泳檢測(cè)通常，使用電泳判斷RNA的完整性。理論上，完整的RNA擁有28S:18S = 2.7:1的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào)28S:18S = 2:1的比例。事實(shí)是，除了細(xì)胞外，從其它樣品中抽提的RNA幾乎都得不到2:1的比例，原因是大分子rRNA的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)程度更高，所以較之小分子rRNA更容易降解；當(dāng)28S有相當(dāng)程度的降解時(shí)，18S (包括mRNA)卻相當(dāng)完整(此結(jié)論使用Agilent Bioanalyzer獲得)。另外，來自不同器官的組織，在確定其mRNA沒有降解的前提下，其比例也有區(qū)別 （如肝/肺的比例較低）。可以說，2

33、:1是高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，但低于2:1并不就是質(zhì)量低。準(zhǔn)確評(píng)估28S:18S比例并不容易，因?yàn)镽NA的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被EB飽和的程度等。電泳后應(yīng)能看到兩條非常明顯的條帶(真核：28S+18S， 原核及細(xì)菌：23S+ 16S)， 其中28S (或者23S) RNA應(yīng)為18S (或者16S) RNA量的1 - 2倍，否則表示RNA樣品的降解。電泳看到多一些條帶不是問題，尤其是非變性電泳條件下。RNA完整性的檢測(cè)，可以使用簡單的非變性電泳。不過要牢記的是：在非變性條件下，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變了泳動(dòng)方式，使之不按真實(shí)大小泳動(dòng)；同時(shí)，條帶不夠緊密，甚至出現(xiàn)多條帶。6

34、5C加熱5-10分鐘后再上樣電泳，可以部分破壞RNA的立體結(jié)構(gòu)，獲得更漂亮的電泳結(jié)果。使用非變性電泳檢測(cè)RNA，當(dāng)用1.0 1.2%的進(jìn)口品牌Agarose電泳，以DNA Marker做對(duì)照，28S和18S條帶分別在2kb和0.9kb左右。最好使用含溴酚藍(lán)/二甲苯青兩種染料的上樣液，因?yàn)镽NA的非變性電泳的帶型可以非常簡單地總結(jié)如下：(由快到慢) 5S RNA、溴酚藍(lán)、18S、28S、二甲苯青、殘留的基因組DNA。柱離心式抽提的RNA，電泳圖可能會(huì)看不到5S RNA，TRIzol方法抽提的可能會(huì)看不到基因組DNA，這都不是問題。如果18S/28S分不開，一種可能是上樣量過大，另外一種可能是時(shí)間

35、不夠。如果18S往下出現(xiàn)彌散，提示降解；如果往上出現(xiàn)彌散，提示上樣量過大及可能鹽殘留過多。使用過的膠和電泳緩沖液是不大可能跑出好的電泳圖的。RNA的分光光度計(jì)檢測(cè)首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的RNA，其A260/280 = 2.0左右。純RNA是因，A260/A280 = 2是果。現(xiàn)在大家卻在拿A260/A280當(dāng)因用，認(rèn)為“如果A260/A280 = 2，所以RNA是純的”，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的RNA樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG等，再測(cè)A260/A280比值。事實(shí)上，許多抽提RNA時(shí)使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在A260和

36、A280處附近有吸收，對(duì)A260/A280產(chǎn)生影響。所以，目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì)RNA樣品在200-300 nm范圍掃描。純RNA的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230和A260是兩個(gè)拐點(diǎn)，A300接近0，A260/A280 = 2左右，A260/A230 = 2左右，A260/A215 = 1左右。如果沒有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測(cè)定A260/A230比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。要考慮設(shè)備的線形范圍(A260要處于0.1 0.5之間)。另外有兩個(gè)有用的現(xiàn)象：在水中測(cè)定A260/A280，比值將變低0.3左右；而在10mM EDTA中測(cè)定的比值比在1mM EDTA中測(cè)定

37、的高0.2左右。    RNA小知識(shí)    1： 涉及RNA的一切操作必須戴手套并頻繁更換。進(jìn)口原裝離心管和原裝移液器頭可以直接用于RNA抽提，并不需要進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)涉及的其它物品，包括移液器桿、電泳槽等，均需做必要的處理。移液器的金屬退頭器是RNA酶的一個(gè)重要來源，實(shí)驗(yàn)前最好取下它。  2： RNA濃度越高，沉淀越快越完全。RNA濃度低于10 ug/ml， 要添加沉淀載體才能有效沉淀。 3:  RNA的組成：     

38、60;   Poly (A) RNA = 2-3% total RNA                          rRNA = 8085% total RNA             

39、;              tRNA = 15 - 20% total RNA  4:  A260： 是測(cè)定RNA濃度(量)的指標(biāo)。                         

40、60; 1 OD (260 nm)總RNA = 40 ug/ml (測(cè)定溶液：水)                           1 OD (260 nm)單鏈RNA = 35 ug/ml (測(cè)定溶液：水) 5： 雜質(zhì)的影響：對(duì)絕大部分實(shí)驗(yàn)來說，純度比完整性更重要，因?yàn)榻^大部分的后續(xù)實(shí)驗(yàn)是酶反應(yīng)。殘留的有機(jī)物，金屬離子，酶

41、等將對(duì)后續(xù)酶反應(yīng)產(chǎn)生巨大的影響。下面的實(shí)驗(yàn)是非常簡單實(shí)用的：RNA樣品37oC溫浴2小時(shí)后，與未溫浴的RNA同時(shí)電泳。如果溫浴后RNA降解超過20%，樣品則可能不適合后續(xù)的酶反應(yīng)。 RNAex Reagent RNAex是基于無介質(zhì)、無苯酚/氯仿抽提理念，研發(fā)成功的抽提 總RNA的水性裂解試劑；抽提過程不使用苯酚/氯仿抽提。該裂解液具有極強(qiáng)的裂解能力。在使核酸游離在液體體系的同時(shí)，快速滅活樣品內(nèi)的RNase，同時(shí)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。變性的蛋白質(zhì)離心后以沉淀方式被去除，而上清中的RNA被異丙醇“選擇性”沉淀下來后， 經(jīng)過簡單的洗滌，最后用水將RNA沉淀溶解，獲得的即是純度高、電泳看不到基因組殘留的總RNA。 RNAex Reagent 可以從眾多樣品中抽提總RNA。樣品包括組織、細(xì)胞、Gram-菌等。部分有特殊前處理要求的樣品，其前處理所需的試劑由用戶自備。 主要特征不使用苯酚/氯仿。裂解/去蛋白同時(shí)進(jìn)行。裂解液用量可低至100 ul操作簡單、快速。  RNAex操作步驟  1： 樣品的